豬偽狂犬病進(jìn)口與國產(chǎn)gE基因缺失活疫苗免疫效果的比較

孟帆 趙岳 樊振華 吳忻 薛翼鵬 米瑞娟 姚敬明

摘要 [目的]了解豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗的免疫效果，同時制定合理的免疫程序。[方法]選用國產(chǎn)和進(jìn)口2種豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，采用2種不同的免疫程序進(jìn)行了免疫對比試驗(yàn)。[結(jié)果]無論是用國產(chǎn)的還是進(jìn)口的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫，試驗(yàn)豬10、20、30、40、50、60、70日齡豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值各組間差異均不顯著（P>0.05）;80日齡，實(shí)行3次免疫的試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值顯著高于2次免疫的試驗(yàn)豬（P<0.05）;90、100、115日齡，實(shí)行3次免疫的試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值極顯著高于2次免疫的試驗(yàn)豬（P<0.01）。整個試驗(yàn)期，通過對國產(chǎn)和進(jìn)口豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫效果的對比，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值各組間差異均不顯著（P>0.05）。[結(jié)論]該免疫試驗(yàn)結(jié)果可為豬偽狂犬病免疫防控程序的應(yīng)用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 豬偽狂犬病;gE基因缺失活疫苗;免疫試驗(yàn)

中圖分類號 S859文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0091-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.028

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract [Objective] To understand the immune effect of gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus and establish reasonable immune procedure.? [Method] Domestic and imported gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus were selected and 2 different immune procedures were used to conduct the immune contrast test. [Result] There was no significant difference（P>0.05）of the average S/N mean value of gB antibody against porcine pseudorabies virus between domestic and imported gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus at 10，20，30， 40，50， 60，70 dayages.? And the average S/N value of gB antibody against porcine pseudorabies virus in the third immunization group was significantly higher than that in the second immunization group （P<0.05） at 80dayage. At 90，100，115 dayages， the average S/N value of gB antibody against porcine pseudorabies virus in the third immunization group was significantly higher than that in the second immunization group（P<0.01）. During the whole trial period，? there was no significant difference in the average S/N value of gB antibody against porcine pseudorabies virus between domestic and imported gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus among all groups （P>0.05）. [Conclusion]The research results could provide the basis for the application of the immune prevention and control program of pseudorabies in pigs.

Key words Pseudorabies;gEgenedeleted attenuated vaccine;Immunity test

作者簡介 孟帆（1980—），女，山西太原人，副研究員，碩士，從事動物疫病分子生物學(xué)檢測與診斷技術(shù)研究。*通信作者，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事動物疫病分子生物學(xué)檢測與診斷技術(shù)研究。

收稿日期 2018-12-10

豬偽狂犬病（pseudorabies，PR）是一種由豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染導(dǎo)致的一種以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為主的高度接觸性、急性傳染病[1-3]。該病的主要宿主和傳染源是豬[4]， 可通過消化道和呼吸道傳播，也可通過交配、精液、胎盤垂直傳播。

該病自1902年匈牙利首次被發(fā)現(xiàn)以來廣泛分布于世界各地，已有50多個國家和地區(qū)報(bào)道該病的流行。我國自1948年首次報(bào)道該病后，迄今已有多個省份相繼報(bào)道了該病， 并在許多種豬場呈暴發(fā)流行趨勢，給我國養(yǎng)豬業(yè)特別是集約化養(yǎng)豬造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。近年來種豬場對該病的免疫防控非常重視，但在臨床上母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊以及仔豬神經(jīng)癥狀等現(xiàn)象時有發(fā)生。筆者從不同地市的11個規(guī)模型種豬場采集血樣，用豬偽狂犬病gE抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)母豬豬偽狂犬病野毒感染率為57.94%，仔豬感染率為34.66%，達(dá)到凈化該病的目標(biāo)任務(wù)還很艱巨。筆者選用國產(chǎn)和進(jìn)口豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，對仔豬進(jìn)行2次或3次免疫試驗(yàn)，旨在為選擇疫苗、探索有效的免疫程序提供科學(xué)依據(jù)，為有效控制該病的流行提供一種技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑盒。豬偽狂犬病病毒gB 和gE 蛋白ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)豬群。近幾年來對20個示范豬場檢測豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒免疫抗體和感染抗體的基礎(chǔ)上，選擇大同陽高×種豬場（gE抗體檢測為陰性），2015年9月在免疫試驗(yàn)前對該豬場母豬每次免疫后進(jìn)行跟蹤檢測豬偽狂犬病病毒gB 和gE抗體，2016年9月對該豬場不同日齡仔豬進(jìn)行了抽查檢測，再次確定該豬場母豬、仔豬豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測全部為陰性時，選擇該場60頭母豬，300頭仔豬為試驗(yàn)豬群。

1.1.3 試驗(yàn)疫苗。進(jìn)口、國產(chǎn)豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗分別購自美國某公司和上海某生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動物分組與免疫。在試驗(yàn)場根據(jù)母豬懷孕產(chǎn)子情況，選擇60頭母豬、300頭仔豬，隨機(jī)分成4組，每組選擇40頭左右仔豬進(jìn)行免疫試驗(yàn)。

試驗(yàn) Ⅰ 組：用美國某公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬母豬每年2、5、8、11月進(jìn)行4次普防，劑量2頭份/頭;仔豬1日齡滴鼻，35日齡注射，劑量1頭份/頭。試驗(yàn)Ⅱ組：用美國某公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬母豬每年2、5、8、11月進(jìn)行4次普防，劑量2頭份/頭;仔豬1日齡滴鼻，35日齡、65日齡注射，劑量1頭份/頭。試驗(yàn)Ⅲ組：用上海某生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬母豬每年2、5、8、11月進(jìn)行4次普防，劑量2頭份/頭;仔豬1日齡滴鼻，35日齡注射，劑量1頭份/頭。試驗(yàn)Ⅳ組：用上海某生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬母豬每年2、5、8、11月進(jìn)行4次普防，劑量2頭份/頭;仔豬1日齡滴鼻，35日齡、65日齡注射，劑量1頭份/頭。

1.2.2 采血時間及方式。對母豬每次免疫后20 d從頸靜脈或耳靜脈隨機(jī)采集血樣20頭，每頭采血3～5 mL，檢測1次gB 和gE抗體。對免疫試驗(yàn)仔豬，每10 d定時隨機(jī)從試驗(yàn)豬前腔靜脈采集血樣10份左右，每份采血3～5 mL，并及時分離血清，-20 ℃下冷凍保存，備用。

1.2.3 抗體檢測和判定方法。采用阻斷 ELISA 法進(jìn)行抗體檢測，具體步驟嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒使用說明書進(jìn)行操作）。

1.2.3.1 抗體檢測方法。首先配制洗滌液，稀釋樣品及陰性、陽性對照，取抗原包被板設(shè)置陰性和陽性對照，加樣后37 ℃孵育，再棄去孔中液體，用洗滌液洗板;然后，加酶標(biāo)記物37 ℃孵育，用洗滌液洗板。接著，再加入底物液A、B 混合于室溫（20～25 ℃）避光顯色，最后加入終止液混勻后在10 min內(nèi)于 630 nm 處測定各孔的OD 值。

1.2.3.2 結(jié)果判定。

（1）豬偽狂犬病病毒gB蛋白ELISA抗體檢測。在酶標(biāo)儀上測定各孔OD630 nm值。試驗(yàn)成立的條件如下：陰性對照孔平均OD630 nm值-陽性對照孔平均OD630 nm值≥0.4。S=樣品孔OD630 nm值，N=陰性對照孔平均OD630 nm值，若S/N值≤0.6，樣品判定為抗體陽性;若S/N>0.7，樣品判定為抗體陰性;若0.6

（2）豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測。在酶標(biāo)儀上測定各孔OD630 nm值。試驗(yàn)成立的條件如下：陰性對照孔平均OD630 nm值-陽性對照孔平均OD630 nm 值≥0.3。S=樣品孔OD630 nm值，N=陰性對照孔平均OD630 nm值。若S/N值≤0.35，樣品判定為抗體陽性;若S/N>0.4，樣品判定為為抗體陰性;若0.35

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)前母豬體內(nèi)豬偽狂犬病病毒gB和gE抗體檢測結(jié)果 在母豬每個季度進(jìn)行普免后20 d，采集血樣進(jìn)行豬偽狂犬病病毒gB和gE抗體檢測。由表1可知，豬偽狂犬病病毒gB抗體全部為陽性，gE抗體全部為陰性。

2.2 免疫試驗(yàn)前仔豬體內(nèi)豬偽狂犬病病毒gB和gE抗體檢測結(jié)果 2016年9月在開展免疫試驗(yàn)前，對豬場10～60日齡仔豬進(jìn)行豬偽狂犬病病毒gB抗體和gE抗體抽檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)gB抗體全部為陽性，gE抗體全部為陰性（表2）。

2.3 試驗(yàn)期間仔豬體內(nèi)豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測結(jié)果 對分組免疫試驗(yàn)仔豬，在免疫后每隔10 d進(jìn)行采血，檢測豬偽狂犬病gB抗體。由表3可知，在整個試驗(yàn)期，無論是用上海某生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫2次的試驗(yàn) Ⅰ 組與免疫3次的試驗(yàn) Ⅱ 組相比，還是用美國某公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫2次的試驗(yàn)Ⅲ組與免疫3次的試驗(yàn)Ⅳ組相比，試驗(yàn)豬10、20、30、40、50、60、70日齡豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值各組間差異均不顯著（P>0.05）。試驗(yàn)豬80日齡，試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異顯著（P<0.05）;試驗(yàn)Ⅲ組與試驗(yàn)Ⅳ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異顯著（P<0.05）。試驗(yàn)豬90、100、115日齡時，試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異極顯著（P<0.01）;試驗(yàn)Ⅲ組與試驗(yàn)Ⅳ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異極顯著（P<0.01）。無論是用上海某生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗還是用美國某公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗進(jìn)行3次免疫的試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅳ組抗體可以維持較長時間。

由表3還可知，整個試驗(yàn)期，試驗(yàn) Ⅰ 組與試驗(yàn)Ⅲ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異均不顯著（P>0.05），試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅳ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異也不顯著（P>0.05）。

3 討論

豬偽狂犬病對世界各國養(yǎng)殖業(yè)的危害是極大的，目前防控和根除豬偽狂犬病的主要措施還是免疫接種疫苗，不同規(guī)模生豬養(yǎng)殖場中主要應(yīng)用豬偽狂犬病疫苗進(jìn)行免疫[6]。自2011年以來，豬偽狂犬病在國內(nèi)豬場大范圍暴發(fā)，從華北、華中到華東、華南均有發(fā)生[7]，陰性豬場紛紛轉(zhuǎn)陽，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在豬偽狂犬病猖狂暴發(fā)的大環(huán)境下，除了需要選擇有保護(hù)力的疫苗外，制定合適的免疫程序也是豬只自身增強(qiáng)對病毒感染的抵抗力、防止病毒激活、減少病毒傳播率的關(guān)鍵所在。為了加強(qiáng)對豬偽狂犬病的防控力度，當(dāng)前大部分豬場普遍采用的是公豬、母豬4次普防，仔豬3次免疫的免疫程序。雷宇平等[8]曾報(bào)道2015年山西省母豬群野毒感染率達(dá)49.06%，處于相對較高水平，可見山西省豬偽狂犬病野毒感染普遍存在且比較嚴(yán)重，這對山西省生豬養(yǎng)殖行業(yè)的影響是不容低估的。筆者選用國產(chǎn)和進(jìn)口豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，在豬偽狂犬病陰性豬場對仔豬進(jìn)行2次或3次免疫，對比其免疫效果，以期為山西豬偽狂犬病的防控提供一種技術(shù)支持。

目前我國大部分生豬養(yǎng)殖場防控豬偽狂犬病主要使用gE 基因缺失活疫苗，因?yàn)槭褂眠@種疫苗可以通過血清學(xué)方法區(qū)分自然感染豬和免疫豬[9]。該試驗(yàn)選用國產(chǎn)和進(jìn)口豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬、母豬4次普防，在豬偽狂犬病陰性豬場對仔豬進(jìn)行2次或3次免疫，結(jié)果表明無論是用國產(chǎn)的還是進(jìn)口的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗進(jìn)行免疫，試驗(yàn)豬前70日齡豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值各組間差異均不顯著（P>0.05）;80日齡，實(shí)行3次免疫的試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值顯著高于實(shí)行2次免疫的試驗(yàn)豬（P<0.05）;90、100、115日齡，實(shí)行3次免疫的試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值極顯著高于實(shí)行2次免疫的試驗(yàn)豬（P<0.01）。由此可見，公豬、母豬實(shí)行4次普防，仔豬3次免疫的免疫程序最佳。這與張敏等[10]研究的仔豬實(shí)行3次免疫的免疫程序在豬偽狂犬病陰性豬場能取得較好的免疫效果相一致。戴愛玲等[11]也認(rèn)為在臨床上加強(qiáng)疫苗免疫可以降低發(fā)病豬臨床癥狀的發(fā)生。

整個試驗(yàn)期，國產(chǎn)和進(jìn)口的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫試驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn)，進(jìn)口的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫后試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值高于國產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫后試驗(yàn)豬的偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值，但差異均不顯著（P>0.05），可見不論是進(jìn)口的還是國產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗給豬免疫都可以產(chǎn)生良好的免疫效果，這與姚敬明等[12]的研究結(jié)果相一致，這些疫苗都可以推廣應(yīng)用。

豬偽狂犬病作為危害目前規(guī)模化豬場的主要傳染病之一，能引起種豬的繁殖障礙、仔豬的神經(jīng)癥狀及高死亡率以及生長育肥豬的呼吸道病綜合征。盡管目前我國的免疫防控水平非常高，技術(shù)也十分成熟，但該病并沒有被徹底消滅，給養(yǎng)豬場帶來的經(jīng)濟(jì)損失仍然非常嚴(yán)重。根據(jù)我國《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020 年）》考核標(biāo)準(zhǔn)，2020 年全國所有種豬場達(dá)到豬偽狂犬病凈化標(biāo)準(zhǔn)。血清學(xué)調(diào)查是制訂凈化策略的基礎(chǔ)，因此加強(qiáng)免疫防控，定期進(jìn)行豬偽狂犬病病毒gB/gE抗體檢測，制定適合本場豬群的最佳免疫程序和凈化方案是防控豬偽狂犬病的根本措施。此外，還需要科技人員、豬場技術(shù)人員和管理人員共同不懈努力，爭取早日實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。

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