DMN誘發大鼠肝纖維化庫普弗細胞與肝星狀細胞的分布

李學文　蘇萬玲　劉旭　肖玉佳　鄭美龍　曹志偉　張靜

【摘要】 目的：探討二甲基亞硝胺（DMN）誘發大鼠肝纖維化庫普弗細胞與肝星狀細胞的分布及其意義。方法：選取40只Wistar雄性大鼠連續4周腹腔注射10 g/L DMN制備肝纖維化模型。采用隨機數字表法分為模型組（n=20）與正常組（n=20），兩組均應用DMN進行肝纖維化造模。采用Reiman法測定大鼠第4周和第7周ALT、AST水平，免疫組化法測定兩組大鼠庫普弗細胞與肝星狀細胞標志物ED1與α-SMA分布情況，收集并分析兩組肝/體質量比、肝組織病理變化、膠原纖維面密度。結果：模型組第4周和第7周ALT、AST、面密度水平均高于正常組，差異均有統計學意義（P<0.05）;模型組第4周和第7周總蛋白（TP）、肝/體質量比水平均低于正常組，差異均有統計學意義（P<0.05）;兩組第4周與第7周肝/體質量組內比較，差異均無統計學意義（P=0.11）;模型組第4周和第7周光鏡下可見ED1、α-SMA陽性細胞數量較多，主要分布于增生的纖維組織及纖維間隔彌漫部位。結論：DMN可導致大鼠肝功能障礙及彌漫肝硬化。大鼠肝纖維化模型的庫普弗細胞可激活、活化肝星狀細胞。

【關鍵詞】 二甲基亞硝胺; 庫普弗細胞; 肝星狀細胞; 肝纖維化; 大鼠

【Abstract】 Objective：To investigate the distribution and significance of Kupffer cells and hepatic stellate cells in rat hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine（DMN）.Method：40 Wistar male rats were intraperitoneally injected with 10 g/L DMN for 4 weeks to prepare the hepatic fibrosis model.All rats were divided into model group（n=20）and normal group（n=20）according to the random number table method.DMN was used to establish liver fibrosis model in both groups.The levels of ALT and AST in two groups were measured by Reiman method at the 4th and 7th week.The distribution of ED1 and alpha-SMA markers in Kupffer cells and hepatic stellate cells of rats were determined by immunohistochemistry.The liver/body mass ratio，pathological changes of liver tissue and surface density of collagen fibers in two groups were collected and analyzed.Result：The levels of ALT，AST and area density in the model group were higher than those in the normal group at the 4th and 7th week（P<0.05）.The levels of total protein（TP）and liver/body mass ratio in the model group were lower than those in the normal group at the 4th and 7th week（P<0.05）.There was no significant difference in liver/body mass time between the two groups at the 4th and 7th week（P=0.11）.The number of ED1 and α-SMA positive cells in the model group were higher at the 4th and 7th week under light microscope.These were mainly distributed in the proliferative fibrous tissue and the diffuse part of the fibrous septum.Conclusion：DMN can cause liver dysfunction and diffuse cirrhosis in rats.Kupffer cells in rat hepatic fibrosis model can activate and activate hepatic stellate cells.

【Key words】 DMN; Kupffer cells; Hepatic stellate cells; Hepatic fibrosis; Rats

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.13.008

肝纖維化是臨床常見的肝臟疾病[1]。相關研究表明，庫普弗細胞可通過內毒素等介導下通過多種機制調控肝纖維化進程[2]。該過程的核心是激活肝星狀細胞[3]。目前，國內外對DMN誘發大鼠肝纖維化模型的相關研究報道較多，但對于該模型庫普弗細胞與肝星狀細胞分布情況報道甚少。本研究以40只Wistar雄性大鼠制備肝纖維化模型，探討DMN對該模型庫普弗細胞與肝星狀細胞的影響，為臨床研究提供實驗研究基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取本院2018年1-4月實驗動物中心提供的40只清潔級Wistar雄性大鼠，體質量160～180 g，平均（169.26±0.37）g。所有大鼠均常規飼養1周后進行肝纖維化造模實驗。DMN購自USA Sigma公司;鼠抗兔ED1試劑購自US Serotec公司;直接紅購自Aldrich Chem公司;單克隆鼠抗人α-SMA購自Denmark Dako公司;ALT、AST及TP試劑盒均購自北京中山生物技術公司。本研究經本院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備 參照Matsuda方法[4]，將40只大鼠按照隨機數字表法分為模型組（n=20）與正常組（n=20）。模型組制備方法：將10 g/L DMN用適量0.9%氯化鈉溶液稀釋，按照1 mL/kg的劑量連續3 d/周腹腔注射，共注射4周。正常組按照同樣的注射方法注射等量的0.9%氯化鈉溶液。兩組在第4周和第7周分別選取10只大鼠，測定體質量。采用乙醚麻醉，心臟采血，3 000 r/min離心15 min，留血清，冷凍、備用。采血后立即處死大鼠并常規摘取大鼠肝臟，稱量，計算肝/體質量比。

1.2.2 相關指標檢測方法 采用Reiman法測定大鼠血清ALT、AST活性;采用Biuret法測定總蛋白（TP）含量，所有操作均嚴格按照相關試劑盒說明書進行。采用分光光度計在490 nm測定ALT、AST及TP吸光度（D），參照標準曲線計算ALT、AST及TP活性及含量。

1.2.3 病理學檢查 用40 g/L中性甲醛常規固定大鼠肝左葉組織，石蠟包埋、切片。采用1 g/L直接紅染色肝組織，光鏡下觀察組織纖維化程度。采用CMIAS系統（北京航空航天大學）檢測肝臟組織膠原纖維面密度情況。物鏡放大倍數為4倍;每張切片均隨機選取4個視野。免疫組化染色：切片（厚度：4～5 μm）常規脫蠟，采用SP法染色，ED1與α-SMA工作濃度為1︰500、1︰50。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，采用SNKq檢驗進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組相關指標變化情況 實驗過程中，兩組均無大鼠死亡。隨著時間的推移，兩組ALT、AST及TP水平均下降，差異均有統計學意義（F=5.52、6.26、4.65，P<0.05）;兩組第4周與第7周肝/體質量組內比較，差異均無統計學意義（F=3.26，P=0.11）;模型組第4周和第7周ALT、AST、面密度水平均高于正常組，差異均有統計學意義（F=4.17、5.35、4.93，P<0.05）;模型組第4周和第7周TP、肝/體質量比水平均低于正常組，差異均有統計學意義（F=5.74、4.71，P<0.05），見表1。

2.2 兩組第4周與第7周病理組織變化情況 正常組在第4周和第7周肝左葉切片光鏡隨機4個視野下均顯示正常肝組織結構，無變性、壞死，可在匯管區見些許纖維組織。模型組第4周肝左葉組織切片光鏡下可見結構紊亂，有變性、壞死，可在匯管區見大量纖維組織增生，存在假小葉。模型組第7周肝左葉組織切片光鏡下可見結構紊亂，有肝細胞變性、壞死，但程度較第4周減輕。免疫組化染色結果：正常組第4周與第7周光鏡下均可見肝實質、匯管區等分布少量、散在的ED1陽性細胞，少量α-SMA陽性細胞分布于中央靜脈壁，肝細胞間無陽性細胞分布。模型組第4周與第7周光鏡下均可見ED1、α-SMA陽性細胞數量較多，主要分布于增生的纖維組織及纖維間隔彌漫部位，肝實質中有少量散在分布，見圖1、2。

3 討論

肝纖維化是臨床亟須解決的世界性健康問題。目前，臨床運用肝臟移植方法治療晚期肝硬化[5]。在過去幾十年間，肝纖維化與肝硬化是否可以逆轉一直存在爭議。近年來，隨著國內外對肝纖維化的研究不斷深入，逐漸意識到肝纖維化是可能逆轉的[6-7]。DMN是誘導大鼠肝纖維化模型常用的試劑，具有良好特性。DMN長期小劑量腹腔注射給藥大鼠可誘發肝腫瘤，而大劑量可誘發肝纖維化[8-9]。相關研究表明，大鼠連續4周（3次/周）腹腔注射DMN可誘發與人酒精性肝硬化相似的肝硬化模型[10]。另有研究表明，四氯化碳（CCl4）與DMN均可誘發大鼠肝纖維化模型，但DMN停藥后大鼠仍可維持幾個月的肝硬化特點[11-12]。

本研究中，模型組第4周ALT、AST水平均高于正常組，而TP含量低于正常組（P<0.05），表明DMN可導致大鼠肝功能明顯損傷。另外，本研究模型組第7周ALT、AST均仍處于較高水平，表明DMN導致大鼠肝功能損傷依舊明顯。本研究中，模型組第4周肝/體質量比水平低于正常組（P<0.05）;病理學結果顯示，大鼠第4周肝左葉組織切片光鏡下可見結構紊亂，有變性、壞死，可在匯管區見大量纖維組織增生，存在假小葉。模型組第7周肝/體質量比水平高于第4周，但差異無統計學意義（P>0.05）;病理學結果顯示，大鼠第7周肝左葉組織切片光鏡下可見結構紊亂，有肝細胞變性、壞死，但程度較第4周減輕，肝硬化特點仍繼續維持。

肝纖維化的中心通路是激活庫普弗細胞，其參與調控肝纖維化過程，釋放腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β等作用于肝星狀細胞，進而促使肝星狀細胞轉化為成纖維樣細胞，并表達α-SMA[13-15]。正常肝組織中有兩種庫普弗細胞，一種是ED1陽性、ED2陰性的細胞主要分布于中央靜脈及門脈血管周圍;另一種是ED1與ED2均為陽性的肝組織巨噬細胞，其主要分布于血竇周圍[16-18]。單克隆抗體ED1可識別庫普弗細胞。相關研究運用CCl4制備大鼠肝纖維化模型，發現模型第9周有較多的ED1陽性細胞，分布于纖維間隔[19]。Lan等[20]研究發現，ED1陽性細胞主要聚集在纖維間隔和變性被膜纖維部位。本研究中，模型組第4周、第7周庫普弗細胞與肝星狀細胞均主要分布于增生的纖維組織及纖維間隔彌漫部位。表明，DMN誘發大鼠纖維化模型庫普弗細胞與肝星狀細胞存在相關性，深入研究兩者之間的作用機制，可能對肝纖維化治療方面提供新的思路。

綜上所述，DMN可導致大鼠肝功能障礙及彌漫肝硬化。大鼠肝纖維化模型的庫普弗細胞可激活、活化肝星狀細胞。

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（收稿日期：2019-01-07） （本文編輯：周亞杰）