基于生物質譜的蛋白質組學在甲狀腺乳頭狀癌中的應用進展

趙婉君，張 勇，付琳茹，楊 浩，朱精強

(1.四川大學華西醫院 a.甲狀腺外科， b.移植免疫研究室/華西-華盛頓線粒體與代謝研究中心，成都 610041；2.四川大學華西臨床醫學院，成都 610041)

甲狀腺癌作為內分泌最為常見的惡性腫瘤[1]，其發病率近年來呈快速增長趨勢，有研究顯示2008年以來患病率較1998—2008年翻了2倍[2]。2015年癌癥中心統計表明甲狀腺癌已成為美國女性惡性腫瘤的第5位[3]，韓國女性惡性腫瘤的第1位[4]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)來源于甲狀腺濾泡上皮細胞，作為甲狀腺癌最常見的病理類型，占比高達90%[1,5]，PTC患者男女比例為1∶3.69，中位診斷年齡為50歲[6]。PTC作為淺表軟組織腫瘤，具有發病隱匿、早期無明顯臨床表現、良惡性識別難度高、淋巴結轉移迅速的特點[7]。現有研究表明，PTC發生發展是長期、多因素、分階段的復雜過程，由多基因[如鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(BRAF)、甲狀腺濾泡細胞發生大鼠肉瘤癌基因(RAS)、RET(RET proto-oncogene)、p53等][8]和環境因素(放射接觸史、碘攝入等)[9-10]共同參與，但具體機制尚不明確[6]。除此之外，目前篩查主要依靠甲狀腺專科彩色多普勒超聲，診斷金標準為超聲引導下細針穿刺活檢，有創且需要病理專家的配合，基層醫院難以開展[11]。此外，臨床上缺少高敏感性和特異性的分子診斷標志物以及識別復雜難治病理的關鍵標志物。因此，篩選甲狀腺腫瘤分子標志物在術前判斷甲狀腺腫瘤良惡性以及精細化區分PTC的侵襲性亞型也是臨床的迫切需要，將使部分患者避免不必要的外科手術，提高治愈率。現對基于生物質譜的蛋白質組學在PTC的診斷、分型和預后等方面的研究進行總結，為PTC的診療發展提供新的思路和依據。

1 基于生物質譜技術的腫瘤蛋白質組學概述

2001年，人類基因組測序計劃的完成促使科學家對人類基因組的功能進行研究[12-13]。隨著基于生物質譜的蛋白質鑒定技術的發展，標志著“蛋白質組學”這一全新領域的誕生，其以蛋白質組為研究對象，從整體的角度分析細胞、組織、器官動態變化的蛋白組成和活動規律[14]。蛋白質組學的核心技術是生物質譜技術，通過測定質荷比進行蛋白質組成和結構分析，離子化方式主要分為基質輔助激光解析電離[15]和電噴霧電離[16]，具有高通量、高靈敏度、低檢測線、自動化等特點[17-18]。蛋白質組學能夠破譯基因的編碼信息，包括氨基酸序列、翻譯后修飾、蛋白質-蛋白質相互作用等[19]。2014年，《自然》雜志的一篇文章公布了人類蛋白質組草圖，全面覆蓋了超過80%的人類預期蛋白質組，還發現了一些新的蛋白質，為人類腫瘤蛋白質組學研究奠定了基礎[20]。2019年2月，中國肝細胞癌蛋白質組學研究也取得了突破性成果，提出了基于蛋白質組學的早期肝癌分型以及靶向治療靶點[21]。在基因表達成蛋白質的過程中，多種影響因素決定腫瘤的表型，包括基因組、轉錄組以及蛋白質組水平的改變。根據“中心法則”，蛋白質組水平與腫瘤表型關系最為密切，蛋白質表達量、穩定性及修飾的改變等都可能影響蛋白質的功能[22]。借助先進的生物質譜技術，研究生物體內腫瘤發生、發展相關蛋白質組的變化規律，有助于發現腫瘤早期診療相關生物標志物和治療靶點[23]。腫瘤細胞和正常細胞由于基因功能表達以及蛋白質組成等方面的不同會導致生物學行為差異，因而通過比較兩者之間蛋白質種類、表達量、修飾狀態的差異，分析差異表達蛋白質的結構與功能，可能找到與腫瘤診斷、分子分型、精準治療相關的高特異度和高靈敏度蛋白質標志物，揭示腫瘤發生、發展的分子機制。Zhang等[24]對95例結直腸癌樣本進行基于質譜的蛋白質組學分析，并基于蛋白質組學結果將其分成了5種亞型，并第一次綜合分析了人類癌癥的“蛋白組-基因組學”特征，推動了結直腸癌診斷和治療的發展。Mertins等[25]對105例乳腺癌樣本進行基于質譜的定量蛋白質和磷酸化修飾分析，展現了基于質譜的高通量蛋白質組技術在癌癥分子分型中的能力。Zhang等[26]對169例高級別漿液性腺癌的卵巢癌樣本進行了基于質譜的蛋白質組分析，鑒定到一些關鍵蛋白質，與基因組數據整合對該疾病提出了一些新的見解。Ge等[27]對84例彌漫性胃癌樣本進行了定量蛋白質組學研究，并根據蛋白質組結果將其分成3個亞型，揭示了一些潛在的治療靶點。總之，基于生物質譜的腫瘤蛋白質組學展示出越來越強的能力，為理解腫瘤生物學提供了新思路，并推動腫瘤診療向精準醫療方向發展。

2 蛋白質組學在PTC領域研究的突破口

研究表明,PTC的生物學行為差異較大，有終生無變化的微小癌，也有血管侵襲、血性播散至肺、肝、骨和腦等高死亡特性的腫瘤，但是造成這種差異的機制不明[28-30]。現有關PTC發生、發展的研究多集中于基因層面，大多數典型PTC與鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1 V600E的突變具有顯著相關性[31]。此外，研究還發現PTC與大鼠肉瘤癌基因、RET、端粒酶逆轉錄酶基因、p53等有直接或間接的關系[32]。另有研究發現微RNA(microRNA，miRNA)，如miR-146、miR-221、miR-222、miR-155、miR-181等的上調對PTC的發生發展有重要作用[20]。但基因突變、mRNA的改變與最終蛋白表達的功能實現有顯著差異。因此，針對蛋白質功能實現的靶向篩選還有很大的研究空間。如何通過分子層面找到PTC的關鍵靶點，是病因探索的方向，同時也是尋找靶向藥物的前提和基礎。對于雌激素、碘攝入、橋本甲狀腺炎等因素對PTC發生發展影響作用的研究僅停留在發現臨床現象層面，并未深入明確其相互影響的作用機制，這也是臨床較為關注的熱點問題。

早期診斷對PTC至關重要，細針針吸細胞學是目前診斷PTC最行之有效的方法。然而，其對病理科醫師的專業經驗及能力要求較高，即使是從業10年的病理科醫師也仍有15%～30%無法明確診斷[20]。無法判斷的病理表現為濾泡上皮細胞的不典型增生和細胞特點的不典型性，人工難以鑒別。同時，細針針吸細胞學本身為有創操作，患者接受度不高，作為一種檢查手段對患者身心影響較大。因此，尋找體液內(血液、尿液等)更為敏感可靠的腫瘤標志物以提高診斷效能，對于PTC的早期檢測、更好的分類和最佳治療極為必要。關于PTC亞型的分類國內目前開展較少，主要原因是專科病理診斷能力不足，但精準的亞型分型(如高細胞亞型等)識別有助于臨床鑒別生物行為不良的PTC，盡早干預，提高患者預后。因此，尋找到更為精準地區分PTC生物學行為的關鍵標志物，找到PTC腺內播散、淋巴結轉移、遠處轉移生物學行為的關鍵靶點，以它們作為新的分型標準將更好地指導PTC的臨床決策。

目前國際上針對PTC手術策略的爭論點在于手術方式及手術范圍的選擇[33-34]。PTC初始治療的主要目標是降低癌癥死亡率，降低復發風險及相關手術并發癥發生風險，同時提高整體或疾病特異生存率。現階段針對低復發風險(美國癌癥聯合委員分期)、微小癌(癌灶直徑<1 cm)是否過度治療的討論成為熱點。同時針對術前評估僅為孤立癌灶的患者是否進行全切和側葉切除，以及是否進行預防性中央區淋巴結清掃也存在爭議。甲狀腺全切或預防性淋巴結清掃的支持者認為無論是在甲狀腺本身還是在局部淋巴結中，隱匿性疾病的高發均是PTC的顯著特點，徹底的手術方式可以降低疾病復發率，減少再次手術風險[35]。全切后可以加做131I放射輔助治療，提高患者無病生存率[36]。同時，甲狀腺全切后加做131I放射輔助治療可以使血清甲狀腺球蛋白成為術后復發的敏感標志物，提高監測準確性[36]。但其意味著更高的手術并發癥發生率(喉返神經損傷及甲狀旁腺功能減退等)和終生激素替代治療[20]。上述問題的本質在于現有的PTC分期分型精準度對手術方式選擇指導的適用度不夠。如果能夠通過現有的技術，將目前認為微小癌或低復發風險PTC中的生物學行為不良的類型加以識別，精準化手術策略的選擇，將手術風險及手術效果維持在適度的平衡狀態會大大提升患者術后的生存質量及預后。

131I是治療術后復發轉移以及遠處轉移(廣泛肺轉移)的主要武器，但是轉移灶的131I攝取能力是良好治療效果的前提。在臨床實踐中，約有30%伴遠處轉移的PTC患者轉移灶顯示出去分化特性，從而碘耐受[20]。目前針對碘耐受伴廣泛肺轉移的患者并無有效的治療手段，大劑量131I的使用反而給患者帶來不必要的并發癥，影響生活質量。與此同時，PTC去分化機制尚不明確。因此，如何早期識別碘耐受患者或尋找PTC去分化的關建作用點是突破碘耐受PTC治療的首要前提。

3 蛋白質組學在PTC研究中的應用現狀

蛋白質組學研究的方法主要包括收集樣本、提取蛋白、將蛋白酶切成肽段、肽段分級、質譜分析、數據處理、生物信息學分析等步驟。而每個步驟都存在一些挑戰，需根據實際情況優化和應對。目前PTC的相關研究較少，對于其體液和組織的研究仍存在一些挑戰，如對于PTC血漿或血清蛋白質組的研究主要在于高峰度蛋白的存在，蛋白質濃度動態范圍高達12個數量級，蛋白質種類復雜，存在大量蛋白質變體等[37]。

3.1PTC蛋白質組學研究 Wilhelm等[20]發表的基于生物質譜人類蛋白質組草圖中，在正常人甲狀腺中鑒定出2 791個蛋白質，為甲狀腺癌中蛋白質組變化提供了參考。而PTC蛋白質組研究仍然有限，原因包括早期生物質譜技術以及臨床樣品獲取等方面的限制，以及PTC作為治愈率最高的癌癥受到研究者的重視度不夠。Sofiadis等[38]對PTC和甲狀腺濾泡狀癌的蛋白質組進行了表征，采用二維凝膠電泳技術和質譜技術發現了25個差異蛋白點，如膜聯蛋白A5，但是該方法通量低，準確度不高。Ban等[39]利用質譜技術從PTC組織和匹配的正常組織中分別鑒定到524種和432種蛋白質，其中145種蛋白質在癌組織中特異表達，并發現腎連蛋白和malectin 蛋白可能作為PTC的特征生物標志物，在正常與癌組織區分方面展示出蛋白質組優于基因組的能力。陳國群和周亞東[40]探討了甲狀腺包裹性濾泡型乳頭狀癌與普通型乳頭狀癌的蛋白組學，發現了差異表達的蛋白質，有助于甲狀腺包裹性濾泡型乳頭狀癌的早期診斷。在PTC的組織樣本中，人們還發現半乳凝集素3、S100-A6蛋白、組織蛋白酶B、角蛋白19等可作為PTC的良好標志物[41-42]。目前，PTC蛋白質組覆蓋度還不深，研究對象還不全面，目前發現并驗證的差異蛋白質組還不豐富，缺少高靈敏性和高特異性的生物標志物。總之，對PTC蛋白質組學進行深度解析，還需要臨床工作者和基礎研究人員共同努力和協作，建立PTC組織、細針穿刺液、血清、尿液蛋白質組診斷模型，用于PTC早期診斷、術前判斷、分期分級、精準治療、預后判斷等[43-44]。

3.2PTC糖蛋白質組學研究 糖蛋白質組是蛋白質組的一個分支。糖基化是蛋白質最廣泛、最復雜的翻譯后修飾之一，廣泛參與細胞識別、黏附、信號轉導等生物學過程，對于蛋白質的正確折疊、功能定位、胞內運輸等十分關鍵，其異常表達與腫瘤等疾病的發生、發展密切相關[45]。糖基化根據其連接氨基酸的不同主要分為N-糖基化和O-糖基化兩大類，糖鏈結構復雜多樣，糖基化的微觀不均一，糖基化修飾豐度低，在質譜分析前往往需要先富集糖鏈或糖肽，并需要通過專業的軟件進行分析[46]。目前美國食品藥品管理局批準的腫瘤蛋白質標志物中1/3以上是糖基化修飾蛋白，如肝癌的診斷標志物甲胎蛋白[47]，因而研究PTC糖蛋白質組有助于發現新型標志物，幫助人們深入理解其發病機制。

甲狀腺作為內分泌器官對于代謝調控、生長發育非常重要，其腺體內含有大量的糖蛋白，包括甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、促甲狀腺激素、促甲狀腺激素受體等。一旦該器官發生癌變，其糖基化修飾也會異常變化，包括唾液酸化、巖藻糖基化、糖型分枝情況等[48]。研究者觀察到甲狀腺癌中甲狀腺球蛋白的唾液酸化程度下降[49]，核心巖藻糖轉移酶8蛋白的表達量升高與PTC腫瘤大小與淋巴結轉移相關[48,50]。但是目前關于PTC的糖蛋白質組研究較少，人們對其含有的糖蛋白質種類變化、表達量變化、糖基化結構變化、糖基化位點變化、糖基化修飾變化等情況還不了解，需要先進的分析方法和技術進行闡明。

4 小 結

目前關于PTC的發病機制、診斷精準度、治療策略等方面的研究中還有很多問題未解決，這也是將基于生物質譜的蛋白質組學應用于PTC研究的切入點。盡管基于生物質譜的蛋白質組學目前在乳頭狀甲狀腺癌研究中還存在很多困難和挑戰，但是隨著生物質譜技術的進步、蛋白質組學方法的成熟，越來越多的研究者將目光聚焦到甲狀腺癌血漿、尿液等生物樣本中。通過創新的方法和策略篩選可應用于無創或微創診斷、分型以及預后的分子標志物，包括差異表達的蛋白質、糖基化修飾等，并為研究癌癥發病機制提供新的證據，為開發生物治療藥物提供新的治療靶點和思路。