腎纖維化診斷生物標志物研究進展

2019-08-27 00:51:38劉秋玉劉偉偉高建東

醫學綜述 2019年15期

劉秋玉，劉偉偉，高建東

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎病科上海中醫藥大學中醫腎病研究所肝腎疾病病證教育部重點實驗室(上海中醫藥大學)上海市中醫臨床重點實驗室(14DZ2273200),上海 201203)

近年來，慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患病率逐年升高。據報道，中國成人CKD患病率高達13.4%，極大增加了國家的醫療負擔[1]。腎纖維化是CKD的標志，CKD的嚴重程度通常與腎纖維化程度相關[2]。腎纖維化主要包括腎小球硬化、腎小管間質纖維化和腎內血管硬化，其病理特征表現為腎臟固有細胞損傷、炎癥細胞浸潤、肌成纖維細胞和成纖維細胞的活化和增殖、細胞外基質(膠原纖維、纖連蛋白、層粘連蛋白)堆積、腎臟固有細胞丟失、腎小管萎縮塌陷和血管稀疏化，最終導致腎臟正常結構破壞。腎纖維化標志著不可逆性腎損傷，因此早期診斷腎纖維化和針對病因進行治療是延緩CKD進展的關鍵。目前，超聲和磁共振成像等影像學方法用于評估CKD患者的腎纖維化，但這些技術只能從宏觀水平上診斷腎纖維化，無法敏銳地捕捉腎纖維化炎癥反應期的微觀病變信息。而生物標志物既能評估或定量測量某種疾病的生物學和病理學進程，同時也可作為疾病的治療靶點[3]。生物標志物參與了疾病進程的各個環節，其水平隨著疾病進程的活動或進展程度而不斷變化。故確定腎纖維化的最佳生物標志物，有助于早期準確診斷腎纖維化和靶向性防治CKD。現就腎纖維化診斷生物標志物研究進展予以綜述。

1 腎臟損傷類標志物

1.1胱抑素 C(cystatin C，CysC) CysC是分子量為13 000的小分子蛋白質，因其分子量小，故可通過腎小球濾過膜。血液中的CysC不易與其他蛋白質結合，只能通過腎臟排泄，而腎小管不能直接分泌CysC，CysC經腎近曲小管重吸收后被完全代謝分解[4]。CysC是評價腎小球濾過功能的良好指標。許洪濤等[5]提出，CysC不但是一個能更準確、更敏感反映早期腎疾病的指標，且在CKD早期診斷與分期中具有重要臨床價值。姚衛國等[6]的研究發現，在IgA腎病腎小球硬化大鼠模型中，血/尿CysC 水平與腎小球硬化積分和腎小管間質纖維化積分呈正相關，提示血/尿CysC水平可能是反映IgA腎病腎小球硬化和腎小管間質纖維化程度的可靠指標。

1.2腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)/甲型肝炎病毒細胞受體1 KIM-1屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白的一種，其由受損的近端腎小管上皮細胞表達。Zhou等[7]的研究表明，在慶大霉素、汞或鉻誘導的三種急性腎損傷模型中，與其他近端腎小管的毒性生物標志物(尿素氮、血肌酐、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶)相比，尿KIM-1具有較高的敏感性和特異性。在臨床研究中，尿KIM-1被證實是腎小管損傷的早期診斷指標[8]。此外，KIM-1主要在炎癥和纖維化區域內的去分化近端腎小管上皮細胞的腔側表達，這意味著KIM-1可能在腎小管間質纖維化過程中起作用[9]。

1.3視黃醇結合蛋白(retinol-binding protein,RBP) RBP是肝細胞產生的低分子量蛋白。臨床上，RBP是反映腎近端小管損傷的敏感指標，當腎近端小管損傷時，尿中的RBP明顯增多[10]。Pallet等[11]通過連續測量189例腎臟活檢患者尿中的低分子量蛋白(RBP、β2-微球蛋白、α1-微球蛋白)、高分子量蛋白(白蛋白、轉鐵蛋白、IgG)和總蛋白發現，低分子量蛋白尿水平與腎間質纖維化程度呈正相關，尿RBP與CKD患者的腎間質纖維化程度獨立相關。因此，臨床可以通過測量RBP水平評估CKD患者的腎間質纖維化程度。

1.4中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) NGAL是分子量為2 500的脂質運載蛋白，其在受損的腎小管中高表達，是急性腎損傷最有效的標志物之一。有學者使用微陣列研究了53個CKD腎活檢標本，并用活檢標本的微陣列基因表達譜來計算分子評分，結果發現NGAL和KIM-1等的表達水平發生改變，且與腎小管間質纖維化和腎小管細胞損傷的嚴重程度相關[12]。因此，NGAL和KIM-1可作為預測腎小管間質纖維化和腎小管細胞損傷的生物標志物。

2 炎癥和促纖維化因子類標志物

2.1單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1 ,MCP-1) 在腎纖維化早期，炎癥反應起至關重要的作用。炎癥趨化因子，特別是MCP-1，通過聚集炎癥細胞，在炎癥反應中發揮重要作用。MCP-1不但能檢測狼瘡腎炎中的間質炎癥和纖維化[13]，而且在蛋白尿出現之前，可以檢測1型糖尿病腎病早期病變[14]。此外，尿MCP-1有助于評估2型糖尿病腎病患者的腎纖維化程度[15]。Mansour等[16]提出，MCP-1與活檢組織中的纖維化有一定的相關性。研究表明，尿MCP-1可以檢測到腎功能正常成人早期的腎小管間質纖維化[17]。作為隱匿性腎小管間質纖維化的生物標志物，尿MCP-1對早期診斷和干預腎纖維化具有重要意義。

2.2轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)β1TGF-β1是公認的纖維化指標，其參與了多種進行性腎病相關的腎纖維化和炎癥反應。TGF-β1參與腎纖維化主要有以下幾點：①參與炎癥反應，調節多種炎癥和促纖維化因子。②誘導腎臟固有細胞轉分化成肌成纖維細胞，刺激成纖維細胞活化和增殖，促進細胞外基質的產生。③調控基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)和組織型纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物1系統，抑制細胞外基質降解。當發生腎纖維化時，組織、血清和尿液中的TGF-β1水平明顯升高。劉江等[18]研究中指出，IgA腎病纖維化患者的尿TGF-β1/肌酐水平與腎小球、腎小管中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原呈顯著正相關。因此，尿TGF-β1/肌酐可作為腎纖維化活動性病變的臨床檢測指標。Kocer等[19]研究證明，在常染色體顯性多囊腎病腎纖維化中，血清TGF-β1水平明顯升高。Musia等[20]的研究顯示，CKD 3～5期患兒血清和尿液中的TGF-β1水平升高。

2.3MMPs/TIMPs MMPs是參與細胞外基質重構的含鋅內肽酶，其對組織發育和體內平衡至關重要。最初MMPs被認為僅切割細胞外基質蛋白質，但研究發現細胞黏附分子(鈣黏素和整聯蛋白)和生長因子及其受體等也是MMPs的底物[21]。而TIMPs是結合和抑制大部分MMPs的內源性抑制劑。研究表明，尿液和血清中的TIMP-1、TIMP-2、MMP-1、MMP-2、和MMP-9是腎纖維化的早期生物標志物[22-23]。此外，Zhou等[24]研究發現，CKD患者的尿MMP-7水平與腎纖維化評分密切相關。在MMP-7基因敲除小鼠中，MMP-7的敲除改善了由阻塞性腎損傷誘導的纖維化病變和基質基因的表達[24]。尿MMP-9是反映移植腎早期和長期功能的生物標志物，MMP-9增加與腎小管萎縮和纖維化有關[25]。在正常情況下，MMPs/TIMPs系統處于穩定狀態，一旦失衡將導致細胞外基質沉積，腎纖維化不可逆轉。

2.4人附睪蛋白4 (human epididymis protein 4, HE4) HE4是位于染色體20q12～13.1上的基因編碼的N-糖基化蛋白。它是促進腎纖維化的新型成纖維細胞衍生因子，也是泛絲氨酸蛋白酶、MMP-2和MMP-9的抑制劑。最初HE4被認為與精子成熟有關，后其被作為上皮性卵巢癌患者的血清生物標志物。Lebleu等[26]發現，HE4在人和小鼠腎臟組織中上調，它通過抑制絲氨酸蛋白酶35和絲氨酸蛋白酶23來防止Ⅰ型膠原的降解，促進腎纖維化。同時他們還發現，編碼HE4的基因是肌成纖維細胞中上調最多的基因，而肌成纖維細胞是形成腎纖維化的關鍵細胞，表明HE4介導了腎纖維化。Wan等[27]發現，CKD腎纖維化患者早期的血清HE4水平明顯升高，其血清水平與腎纖維化程度相關，說明HE4可作為早期預測腎纖維化的標志物。

3 微RNAs類生物標志物

微RNAs(microRNAs，miRNAs)是約20個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，其在生物體內通過轉錄后調節機制抑制基因表達。miRNAs在細胞增殖、分化、凋亡、器官發育、干細胞生物學、腫瘤發生和轉移以及免疫系統的功能調節中具有重要作用。其具有組織特異性，并在生物體液中穩定存在。腎臟組織中的miRNAs可以用于腎纖維化的組織學檢測[28-29]。目前，miRNAs的定性定量檢測變得相對容易，故體液中的miRNAs成為無創生物標志物的理想來源。

CKD以腎纖維化為特征，TGF-β1是腎纖維化的關鍵因子，它能造成細胞外基質的累積并損害正常的腎功能。TGF-β/Smad3通路在組織纖維化中起重要作用，而miRNAs是TGF-β誘導的腎纖維化的核心成員。在腎損傷期間，TGF-β表達上調并刺激TGF-β1受體，激活Smad3途徑，從而調節腎纖維化中miRNAs的表達。目前，用于腎纖維化診斷的miRNAs主要有miR-21、miR-29、miR-192和miR-200[30]。

3.1miR-21 TGF-β1通過Smad3上調miR-21，miR-21通過靶向不同的基因來控制細胞外基質蛋白(膠原蛋白、纖維連接蛋白、上皮鈣黏素和α-平滑肌肌動蛋白)的合成，進而調節腎纖維化的進程。正常腎臟中miR-21低表達，但在腎臟疾病患者標本及CKD和急性腎損傷動物模型中，其豐度均大大增加。在梗阻性和糖尿病性腎病小鼠模型中，發生纖維化的腎小管間質和腎小球區域均觀察到高表達的miR-21[31-32]。有文獻報道，在糖尿病腎病小鼠的腎纖維化中，miR-21通過增加TIMP-1和減少MMP-9，最終導致細胞外基質沉積[32]。Liu等[33]認為，TGF-β調控組織腎纖維化的關鍵為鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸鹽，腎小管上皮細胞中鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸鹽與TGF-β活化后的miR-21存在關聯，兩者共同影響腎纖維化。Glowacki等[34]首次證明，血清miR-21可作為反映早期腎纖維化的一個可靠標志物。

3.2miR-29 在腎纖維化中，除miR-21外，miR-29家族(miR-29a、miR-29b1、miR-29b2、miR-29c)也廣泛參與了調控細胞外基質蛋白的生成。miR-29家族對大量的細胞外基質蛋白基因具有靶向作用，從而影響了多種細胞外基質蛋白的表達，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白及原纖維蛋白、MMP-2等[35-36]。在高糖培養基中或在TGF-β1誘導下，人腎臟近曲小管上皮細胞中的miR-29表達下調，且有助于多種膠原蛋白基因的表達。Lv等[37]研究表明，尿外泌體miR-29c可作為CKD患者腎功能和腎纖維化的生物標志物。此外有學者提出，狼瘡性腎炎患者尿外泌體中的miR-29c水平與組織學慢性指數和腎小球硬化呈負相關[38]。尿miR-29c與腎慢性程度的相關性，提示其可以用來反映和早期預測組織腎纖維化，是一種新型的非侵入性標志物[38]。

3.3miR-192 與其他器官相比，miR-192在正常腎臟中豐度較高[39]。體內外實驗表明，miR-192通過調控E盒結合鋅指蛋白1/2參與腎小管間質纖維化[40]。據報道，在阻塞性腎病、IgA腎病和高血壓性腎病引起的腎纖維化中，miR-192的表達均上調[41-43]。劉亞楠等[44]的研究表明，miR-192在幼年大鼠單側輸尿管結扎所致的腎間質纖維化模型中表達增加，其可能促進腎間質纖維化的形成。在難治性腎病綜合征患者中，尿miR-192水平有助于判斷腎小球細胞外基質蓄積及腎間質纖維化的程度[45]。

3.4miR-200 miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)通過抑制E盒結合鋅指蛋白1/2和TGF-β2來阻斷 TGF-β介導的上皮-間充質轉化。在不同的腎纖維化動物模型中，miR-200家族的表達量不相同。有學者在高血壓性腎小球硬化患者的腎活檢中發現，miR-200a、miR-200b、miR-141、miR-192、miR-205和miR-429在腎內的表達增加，且其上調程度與疾病的嚴重程度相關[43]。有研究表明，無論導致腎纖維化的是CKD、IgA腎病還是糖尿病腎病，其外泌體miR-200b水平均隨腎纖維化的進展而下降，且非近端腎小管來源的外泌體miR-200b是一種更好的腎纖維化生物標志物[46]。

近年來，新的miRNAs生物標志物不斷被發現。Lv等[47]研究表明，血清中的miR-130b能作為 2型糖尿病腎病腎纖維化的早期診斷標志物。石變華等[48]的研究顯示，在單側輸尿管梗阻大鼠模型中，miR-207在大鼠纖維化腎組織和尿液中表達上調，其為腎臟纖維化的診斷提供新靶點。

4 新型生物標志物

尋找可以精確定量腎纖維化的特異性生物標志物，有助于開發更有前景的腎纖維化治療方法。目前，已發現多種潛在的生物標志物，但其價值有待進一步研究。B細胞淋巴瘤/白血病-3(B-cell lymphoma/leukemia-3,Bcl-3)通過激活核因子κB通路誘導腎臟細胞免疫應答和細胞炎癥反應，參與腎臟纖維化。Chen等[49]研究發現，單側輸尿管梗阻小鼠模型腎組織中的Bcl-3信使RNA和蛋白水平均升高。同時他們還發現，CKD患者血清中的Bcl-3蛋白水平高于正常人，且與血清HE4水平高度相關。Bcl-3參與腎纖維化的機制可能為通過直接與Smad3結合，并保護Smad3蛋白免于泛素化和降解來調節TGF-β/Smad信號轉導途徑[50]。這些證據表明，Bcl-3可作為檢測腎纖維化的新型生物標志物。李曄等[51]發現，新纖維化相關因子表面活性蛋白A2在梗阻性腎組織中高表達，且隨著腎纖維化程度加重，表面活性蛋白A2的表達增加，提示表面活性蛋白A2可能參與了腎纖維化過程。Cho等[52]提出，人類腎臟活檢標本中的腎間質纖維化及小管萎縮和節段性腎小球硬化與血清Klotho蛋白水平降低相關，提示血清和尿Klotho均能預測腎纖維化。此外，血清半乳凝素-3、骨膜素、盤狀結構域受體1、尿波形蛋白信使RNA等也是有廣泛應用前景的潛在腎纖維化生物標志物。

5 小結