藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術的發展與展望

郗欣彤，張杉杉，毛紹名，欒國棟，羅泉，呂雪峰

藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術的發展與展望

郗欣彤1,2，張杉杉2，毛紹名1，欒國棟2，羅泉2，呂雪峰2

1 中南林業科技大學 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004 2 中國科學院青島生物能源與過程研究所 中國科學院生物燃料重點實驗室，山東 青島 266101

生物煉制技術體系是緩解能源和環境危機，推動社會可持續發展的重要選擇，而充足的糖原料供應是生物煉制的基礎。藍細菌光驅固碳合成蔗糖是一種潛力巨大的新型糖原料供應路線。基于高效的藍細菌光驅固碳細胞工廠，可以在單平臺上以太陽能為驅動將二氧化碳和水直接轉化為蔗糖，過程簡單、產品明確、易于提取，而且可以同時達到固碳減排和供應糖原料的效果，具有重要的研究和應用價值。本文回顧了藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術的發展現狀，從合成機制、代謝工程策略、技術延伸應用等層面對其最新進展和所遇到的問題進行了總結介紹，并對該技術未來發展方向進行了展望。

藍細菌，蔗糖，光合作用，代謝工程，鹽脅迫

當今世界，人類社會高度繁榮的物質文明是在石化資源煉制體系的基礎上建立起來的，然而這種發展模式正面臨著來自資源和環境兩方面的危機。以微生物發酵與轉化為核心的生物煉制技術體系，通過天然或人工設計、改造的微生物細胞工廠，將各類可再生資源以環境友好型方式轉化為各類化學品，可以為社會可持續發展提供新的基礎和動力[1]。對于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等模式化的異養微生物細胞工廠而言，糖原料是其生物煉制過程的基礎和保障[2]。目前，糖原料的獲取主要有3種途徑：淀粉類糧食作物 (如玉米等)[6-7]、纖維類生物質 (如秸稈等)、蔗糖類植物 (如甘蔗等)。盡管上述3種途徑都有很大的發展潛力，但同樣都面臨著一些瓶頸問題：淀粉類糧食作物制備糖原料存在“與人爭糧”的問題，纖維類生物質制備糖原料存在預處理酶水解糖化成本過高的問題，蔗糖類植物存在種植區域限制的問題[3]。因此，開發高效的糖類合成技術、拓寬糖類供應來源，建立可持續、低成本、不受區域限制的原料糖制備新路線，對于降低原料成本、促進生物煉制技術體系產業化進程具有重要意義。

藍細菌是一類進行放氧光合作用的原核微生物，能利用光能和二氧化碳自養生長，廣泛分布于海洋、陸地、淡水等各種生態環境中[4]。相比較于高等植物和真核微藻，藍細菌具有結構簡單、生長迅速而且易于進行遺傳操作的特點，通過天然代謝途徑的修飾或異源代謝途徑的引入，可以實現對其胞內碳流、能量流的重新分配，促進各種天然或非天然代謝產物的合成[5-6]。糖類物質是藍細菌中重要的碳水化合物存在形式，也是具有代表性的藍細菌光合生物合成產品[7]。藍細菌天然地可以合成從葡萄糖、果糖等單糖，蔗糖、海藻糖等二糖，到糖原等大分子多糖的眾多類型的糖類物質。蔗糖是廣泛研究的、也是最具代表性的藍細菌糖類代謝產物。大多數淡水藍細菌藻株在面臨鹽脅迫時，會在胞內合成并富集蔗糖作為相容性溶質，以維持胞內外滲透壓平衡[8]。而通過代謝工程改造，已經成功地在部分工程藻株中實現了蔗糖從胞內向胞外的高效分泌，使其可以在培養液中積累，大幅度提高了藍細菌蔗糖的產量[9]，有效提升了藍細菌光驅固碳產糖技術的工程化應用潛力。

相比于傳統的糖原料制備技術，特別是與各種植物生物質糖化過程相比，使用藍細菌進行蔗糖分子的合成和分泌，不需要高能耗、高成本的原料預處理過程，即實現從二氧化碳和太陽能向簡單而明確的糖組分的直接轉化，在工藝和成本上將更具優勢，是一種極具潛力的糖原料生產路線。本文將從藍細菌合成蔗糖的生理和代謝機制、光驅固碳產糖細胞工廠的代謝工程開發策略、光驅固碳產糖技術的擴展應用等方面對該技術的發展現狀和所面臨的問題進行總結，并對其未來前景和發展方向進行展望。

1 藍細菌蔗糖合成的生理、遺傳和代謝背景

1.1 藍細菌蔗糖合成的生理意義

藍細菌廣泛分布在各種生態環境中，需要面臨各種類型環境因子和營養條件的波動[4]。高濃度鹽離子 (Na+、K+等) 造成的鹽脅迫是一種常見而典型的環境脅迫作用。鹽脅迫條件下，藍細菌細胞需要面臨復合的脅迫因子刺激，既有高的鹽離子濃度 (離子脅迫)，也有強的溶液滲透壓(滲透脅迫)，會對胞內蛋白質和膜系統的結構穩定與功能保持造成嚴重威脅。為了適應高鹽條件下的滲透脅迫，藍細菌普遍進化出了胞內快速合成并積累相容性溶質以維持胞內外滲透壓平衡的適應性生存策略。相容性溶質是指微生物細胞在高滲透壓環境下，為了提高胞內水活度而合成，并通過高濃度積累來維持細胞體積和膨壓，而且對細胞正常代謝活性不造成影響的一類小分子代謝物[10]。不同藍細菌藻株中，合成和積累的相容性溶質的類型與藻株的鹽脅迫耐受能力密切相關。通常意義上，鹽耐受能力在0.6 mol/L NaCl以下的藻株被稱為低耐鹽藻株，一般合成海藻糖或/和蔗糖作為相容性溶質 (例如魚腥藻PCC 7120、聚球藻PCC 7942等)；鹽耐受能力在1.7 mol/L NaCl以下的藻株歸為中度耐鹽藻株，通常合成甘油葡萄糖苷為相容性溶質 (例如集胞藻PCC 6803)；鹽耐受能力達到3 mol/L NaCl及以上的藻株為高度耐鹽藻株，則主要合成甜菜堿或谷氨酸甜菜堿作為相容性溶質 (例如鹽澤螺旋藻、鹽生隱桿藻等)[8,11-12]。蔗糖是淡水藻株和部分海水藻株中最具代表性的相容性溶質，已經發現了至少60株藍細菌藻株能在胞內合成蔗糖作為相容性溶質以抵抗高滲透壓脅迫[8]。

除了作為抵抗鹽脅迫的相容性溶質進行應激性合成外，蔗糖在部分藍細菌藻株中還作為輔助性的碳匯途徑存在。作為藍細菌適應晝夜節律、應對環境變化的重要機制，在光照條件下通過卡爾文循環固定的碳往往處于“溢出”狀態，超出細胞生長和復制所需；而這部分溢出的碳以“碳匯”的形式儲存于糖原等多糖大分子和甘油葡萄糖苷、蔗糖等小分子溶質中，可以支撐藍細菌在黑暗條件、饑餓條件下細胞生存和生長的需要[13-15]。在正常條件下，糖原代謝是最主要也是最重要的碳匯機制，而蔗糖、甘油葡萄糖苷合成機制的存在則為藍細菌碳匯網絡的可塑性和柔性提供了保證。在聚球藻PCC 7002中發現，當糖原合成途徑被阻斷時，突變株細胞內蔗糖含量會顯著增加，以作為“溢出”碳流的重新分配的重要途徑[16-17]。當糖原合成能力缺失的PCC 7002藻株處于黑暗環境下時，其胞內增加的蔗糖含量可以為細胞呼吸和自發酵等異化作用提供底物支持，部分替代糖原的作用[16]。

1.2 藍細菌蔗糖合成的代謝機制

藍細菌中的蔗糖合成代謝途徑已經被清楚揭示 (圖1)，與植物中的蔗糖合成途徑相同，藍細菌細胞中的蔗糖合成主要由蔗糖磷酸合成酶 (Sucrose-phosphate synthase，SPS，EC 2.4.1.14) 和蔗糖磷酸磷酸化酶 (Sucrose phosphatase，SPP，EC 3.1.3.24) 兩個酶順序催化完成。首先是，UDP-葡萄糖和果糖-6-磷酸在蔗糖磷酸合成酶作用下合成蔗糖-6-磷酸并釋放一個UDP分子；進而，蔗糖-6-磷酸在蔗糖磷酸磷酸化酶的作用下水解生成蔗糖并釋放一個無機磷酸分子。除了上述SPS-SPP途徑外，一些絲狀藍細菌中 (如魚腥藻PCC 7120、PCC 7119、ATCC 29413) 還存在另一條蔗糖合成途徑，由蔗糖合成酶 (Sucrose synthase，SuS，EC 2.4.1.13) 催化從UDP-葡萄糖 (或ADP-葡萄糖) 和果糖到蔗糖和UDP (或ADP) 的可逆轉化。但在生理狀態下，SuS途徑主要催化蔗糖的水解過程而非合成過程[18-20]。在蔗糖合成途徑之外，能進行蔗糖合成的藍細菌藻株的基因組上通常還會有蔗糖水解酶 (Invertase，INV，EC 3.2.1.26) 的編碼基因，該酶催化蔗糖的降解過程，將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，而與SuS不同的是，invertase催化的蔗糖水解反應為非可逆反應。

圖1 藍細菌蔗糖合成和代謝網絡以及針對性的代謝工程改造策略

1.3 藍細菌蔗糖合成的調控機制

與清晰的蔗糖合成和降解途徑形成鮮明對比的是，現階段對藍細菌蔗糖合成調控機制方面知之甚少，具體體現在鹽脅迫信號感知方式、信號傳遞途徑以及蔗糖合成誘導機制等3個層面上。首先對產糖藍細菌感知鹽脅迫的機制仍有疑問。如前所述，鹽脅迫條件下，藍細菌所面臨的是復合的脅迫環境，既有高濃度的鹽離子脅迫，又有強滲透壓脅迫，而已有證據表明高濃度鹽離子和強滲透壓對細胞是兩種不同的脅迫信號。日本的Murata研究組發現集胞藻PCC 6803在面對鹽脅迫 (高濃度NaCl) 和滲透脅迫 (高濃度山梨醇) 時，其基因轉錄圖譜差別極大，意味著這兩種脅迫引發了不同基因系列轉錄的調控[21]。該研究組在對聚球藻PCC 7942的研究中同樣發現，能產生相同滲透勢的滲透脅迫 (高濃度山梨醇) 與鹽脅迫 (高濃度NaCl) 對細胞體積造成的影響差異顯著，前者使細胞收縮了55%，而后者僅收縮了15%。這兩種脅迫對PCC 7942細胞生理、生化的影響也有很大差異，強滲透壓脅迫下，聚球藻PCC 7942細胞迅速失水，光系統會快速但可逆地失活，而其活性會在細胞重新回到等滲溶液時恢復；而高濃度NaCl脅迫首先通過強滲透壓引發光系統快速而可逆的失活，繼而由鹽離子 (Na+) 對光合作用系統引發不可逆的損傷和失活[22-23]。上述結果表明鹽脅迫中強滲透壓脅迫和高鹽離子濃度脅迫對細胞造成的影響有顯著區別，而這兩種因素在誘導蔗糖合成上的具體作用仍有待揭示。

鹽脅迫信號被產糖藍細菌感知后，如何在細胞內級聯傳遞，并引發系列的基因表達調控也并不完全清楚。微生物細胞中感知、傳導并響應各種環境變化的典型信號轉導系統有單元 (絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，STK) 和雙元 (組氨酸激酶-響應調節蛋白，Hik-Rre) 兩類。藍細菌中，響應鹽脅迫、滲透壓脅迫、金屬離子脅迫、溫度、光強等環境變化的雙元信號系統已經陸續被鑒定[24-26]。在集胞藻PCC 6803中，已經鑒定到至少4組雙元信號轉導系統 (Hik33-Rre31、Hik34-Rre1、Hik16-Hik41-Rre17和Hik10-Rre3) 和一個單元信號蛋白 (SpkG) 可能與鹽脅迫和高滲透壓脅迫感知傳導相關[27]。而在魚腥藻PCC 7120中，雙元信號蛋白OrrA (Alr3768) 已經被證實參與了蔗糖合成的調控[28]。但是，在現階段對絕大多數產糖藍細菌而言，對鹽脅迫信號更加具體、精確的感知和傳導途徑的認識仍然是空白。

理論上，鹽脅迫信號在藍細菌細胞中的傳導最終需要引發蔗糖合成途徑的調控，而已有的研究表明，這種調控可能同時發生在轉錄、翻譯、酶活等多個維度上。在集胞藻PCC 6803中，蔗糖合成關鍵基因的轉錄在鹽脅迫后迅速上調，在0.5 h達到最大值[29]；而聚球藻PCC 7002在鹽脅迫24 h后，和轉錄信號也顯著提高[30]。在翻譯水平上，免疫印跡分析表明，魚腥藻PCC 7120的SPS蛋白在鹽脅迫6 h后，表達量明顯提高，而將細胞重新置于正常環境時 (非鹽脅迫條件)，SPS雜交信號則又降低到背景水平。與之對應的是，非脅迫條件下SPS酶活處在相對較低的水平，在加入80 mmol/L NaCl脅迫6 h后，SPS酶活提高了3倍。當把脅迫后的細胞重新置于基本培養基中，SPS酶活則下降到基礎水平[31]。然而，如前所述，鹽脅迫信號在感知和傳導途徑上認識的缺失，也進一步限制了對蔗糖合成途徑調控機制的精確揭示。SPS、SPP、INV等蔗糖合成和降解途徑的關鍵蛋白在鹽脅迫條件下是如何從蛋白豐度和蛋白活性上發生快速而精細變化的？離子脅迫和滲透脅迫是如何引發這些變化的？這些問題的回答和解決將是深入理解藍細菌蔗糖合成機制、解除現有光合固碳產糖對鹽脅迫的依賴、最終提升藍細菌工程藻株產糖效能的關鍵。

2 藍細菌光驅固碳合成蔗糖的代謝工程策略

天然藍細菌藻株中，蔗糖的合成主要作為相容性溶質以抵御高鹽脅迫導致的滲透壓失衡，當胞內積累的蔗糖濃度足以使細胞內外滲透壓重新平衡時，蔗糖濃度就不會進一步提高，其合成和降解將處于動態平衡狀態，這種天然的蔗糖代謝調控模式從根本上限制了藍細菌蔗糖產量的提升。如圖1所示，通過代謝工程改造，打破鹽脅迫條件下藍細菌蔗糖合成和調控的天然調控模式，是加強蔗糖合成能力、提升藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術應用潛力的重要選擇。

2.1 蔗糖轉運蛋白的導入

解除藍細菌蔗糖合成能力瓶頸的關鍵在于實現蔗糖的胞外分泌，而開發藍細菌光驅固碳合成蔗糖細胞工廠開發取得的最具突破性的進展就是通過蔗糖轉運蛋白的導入而實現的。2012年Ducat等將來自大腸桿菌的基因導入聚球藻PCC 7942，首次實現了蔗糖的胞外分泌[9]。CscB蛋白是一種蔗糖透性酶 (Sucrose permease)，可以完成質子/蔗糖的同向轉運。在大腸桿菌細胞中，CscB蛋白通常促進細胞從酸性環境中吸收蔗糖和質子；而藍細菌的培養環境通常偏堿性，有利于鹽脅迫下合成的蔗糖與質子的同時泵出。Ducat等采用IPTG誘導型的P啟動子控制基因的表達，在150 mmol/L NaCl脅迫和1 mmol/L IPTG誘導條件下，聚球藻工程藻株蔗糖合成效率達到了28 mg/(L?h)，168 h鹽脅迫條件培養后產量達到2.7 g/L[9]。

2016年本實驗室使用一株在高溫高光條件下能夠快速生長的速生聚球藻UTEX 2973進行蔗糖合成研究時發現，基因的導入也可以促進UTEX 2973中蔗糖的分泌[32]。UTEX 2973是近期發現的一種極具工程化應用潛力的藍細菌藻株。該藻株在基因組上與聚球藻PCC 7942具有高達99.8%的相似性 (差異僅包括55個SNP、一個188.6 kb大片段的位置翻轉以及一個片段缺失)，而該藻株卻表現出了顯著提高的環境脅迫適應性和生長速度，在500 μmol photons/(m2·s) 高光和41℃高溫培養條件下，其代增時間只有2.1 h，遠遠超過此前報道過的各種模式藻株[33]。研究還發現，該藻株具有極強的碳水化合物合成潛力，其250 μmol photons/(m2·s)光照和38 ℃的溫度條件下，糖原積累量可以達到干重的50%左右；而受到鹽脅迫時，該藻株同樣在胞內合成并積累蔗糖作為主要的相容性溶質。通過將基因導入UTEX 2973基因組，在鹽脅迫條件下工程藻株中合成的蔗糖中95%以上會分泌至胞外；當使用KCl替代NaCl作為脅迫物時，因為K+對細胞的毒性弱于Na+，蔗糖合成速率可以進一步提高到35.5 mg/(L?h)，而單批次培養的蔗糖產量達到3.5 g/L。該部分研究中還發現，以KCl為脅迫鹽時，UTEX 2973-CscB藻株細胞可以通過離心收集-重懸培養的模式進行半連續式蔗糖合成，經過7次采集 (每次3 d)，累計蔗糖產量可達8.7 g/L[32]。

值得注意的是，藍細菌中蔗糖轉運蛋白的表達受到宿主遺傳、生理和代謝背景的影響。本實驗室將基因導入集胞藻PCC 6803時，發現該基因無法正常表達和發揮功能，工程藻株中合成的蔗糖無法有效分泌至胞外[34]。這就意味著在未來高效光驅固碳合成蔗糖細胞工廠的開發過程中，分泌蛋白與底盤藻株之間的適配性也是需要考慮的問題，通過資源挖掘和酶工程改造提高蔗糖分泌蛋白在特定的藍細菌底盤藻株中的表達和活性，將成為提升蔗糖分泌、強化蔗糖合成的重要策略。

2.2 蔗糖合成途徑的強化和降解途徑的阻斷

除了解決蔗糖分泌的瓶頸問題之外，對藍細菌中直接參與蔗糖合成和降解代謝的節點基因進行改造，也是提高蔗糖合成效率的重要策略，主要包括蔗糖合成途徑的強化和降解途徑的阻斷兩方面。本實驗室在針對集胞藻PCC 6803的蔗糖合成能力強化研究中發現，增強蔗糖合成途徑關鍵基因的表達對提升蔗糖產量有重要意義[34]。通過蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶以及UDP葡萄糖焦磷酸酶三個基因的共同表達，可以將工程藻株的蔗糖產量提升2倍；而阻斷蔗糖合成競爭途徑甘油葡萄糖苷合成的關鍵基因，可以將藻株蔗糖產量提升1.5倍；當兩種策略結合時，獲得的工程藻株相比PCC6803野生型藻株的蔗糖產量提升了4倍[34]。本實驗室對聚球藻PCC 7942的改造中同樣發現，在導入了基因的工程藻株中，過量表達PCC 7942自身的蔗糖合成酶基因，可以將工程藻株的蔗糖產量提高74%；而在和共同過量表達的藻株中，的過量表達可以使單位細胞的蔗糖合成能力提高3倍 (590 mg/L提高至超過1 760 mg/L)[35]。對于處于鹽脅迫狀態的藍細菌藻株而言，當具有足夠的碳源供應時，蔗糖合成途徑的催化活性成為蔗糖合成的限速步驟，強化合成途徑關鍵蛋白的表達可以有效提升蔗糖的生產效率和實際產量。

如前所述，蔗糖作為藍細菌細胞中天然的相容性溶質，其自身代謝存在內源性的平衡機制，蔗糖水解酶invertase的存在可以將過度積累的蔗糖迅速降解為葡萄糖和果糖，繼而經過磷酸化后進入中心代謝。2012年，Ducat等的工作中首次證明在導入了基因的PCC7942藻株中敲除水解酶基因，可以將蔗糖產量進一步提升15%。當把的敲除與糖原合成節點基因的敲除相結合時，最終蔗糖產量得到25%的提高[9]。還有研究發現，在蔗糖合成途徑得到強化的PCC 6803工程藻株[34]中敲除水解酶基因，可以將蔗糖產量進一步提高40%[36]。

2.3 糖原代謝的擾動

光合微藻的一個普遍特征是胞內存在天然的碳匯機制，以儲存卡爾文循環固定的、超出細胞正常生長所需的碳源和能量，藍細菌中最重要、最具代表性的碳匯機制是糖原的代謝。糖原代謝的存在對于藍細菌抵抗環境脅迫、適應營養物質動態變化具有重要意義，然而對于化學品的光驅固碳合成而言，糖原合成被普遍地視為一種主要的競爭途徑[37]。Xu等針對聚球藻PCC 7002的研究發現，通過敲除兩個糖原合成酶基因 (和) 可以徹底阻斷PCC 7002細胞的糖原合成和積累；當糖原合成能力缺失的突變株遇到鹽脅迫時，胞內積累的蔗糖和甘油葡萄糖苷含量均有所提升，其中蔗糖含量大約提高3倍[38]。Ducat在導入了基因的PCC 7942工程藻株中，敲除糖原合成的限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶編碼基因，使工程藻株的蔗糖產量提高了5%–10%[9]。但是需要注意的是，基因的敲除，對細胞的生理魯棒性造成了顯著的影響，面對鹽脅迫時，工程細胞的生長代時從12 h延長至43.5 h，即使經過馴化后，仍然達到20 h[9]，從光驅固碳產糖全過程的綜合效益來考量，通過基因敲除來阻斷糖原合成是否合理仍有待評價。

2018年，本實驗室對糖原代謝和蔗糖合成的關系取得了新的認識。在同樣導入了基因的PCC 7942工程藻株中，使用一個茶堿調控的核糖開關控制GlgC蛋白的豐度，進而實現了對糖原含量的人工調控。然而，在該系統下我們發現當工程藻株中糖原量減少時，鹽脅迫條件下蔗糖含量不但沒有提升反而有所降低，而且在調控范圍內，蔗糖產量與糖原含量成正相關。進一步的研究表明，當在和同時過量表達的工程藻株中，使用強啟動子P過量表達，將糖原含量占細胞干重比從30%提高至50%時，藻株的蔗糖合成能力提升了30%–70%，鹽脅迫2 d內，蔗糖產量從335 mg/L (7 mg/(L?h)) 提高至超過1 170 mg/L (24.4 mg/(L·h))[35]。

在本實驗室的工作[35]和Ducat等的研究工作[9]中，糖原合成-積累與藍細菌蔗糖合成能力表現出不同的關系，而這種不同可能是由培養模式造成的。在Ducat實驗中，NaCl脅迫從培養初期就存在，也就是說工程藻株中蔗糖合成與細胞生物質積累是同步、偶聯的，在這種模式下，阻斷糖原積累，將迫使細胞將“溢出”的碳流和能量流分配給蔗糖合成這一“替代性”碳匯途徑，因此蔗糖合成會有所增加；而本實驗室所采用的是先將藻株培養至對數末期，然后進行鹽脅迫，此時工程藻株的生物量積累已經基本停止，而已經存儲在糖原中的碳源可以作為“儲備碳庫”，為蔗糖合成提供卡爾文循環以外的補充碳流，因而也能提高蔗糖的合成。前后兩組研究的對比也說明，在藍細菌光驅固碳細胞工廠的設計和開發過程中，針對不同環境、生理和代謝狀態，提高細胞天然碳匯機制與人工碳匯途徑之間的適配程度，合理優化碳流分配具有重要意義。

2.4 生物量積累阻斷策略

與糖原代謝擾動策略類似，最大限度地阻斷細胞生物質的積累，以使光合碳流盡可能地向目標代謝產物分配是最近提出的一種藍細菌光驅固碳細胞工廠設計策略。Ducat研究組在聚球藻PCC 7942中通過對一種重要響應性調控因子RpaB (Regulator of phycobilisome-associated B) 的過量表達，實現了工程藻株細胞生物質積累的有效阻滯，意味著通向細胞生物質合成途徑的光合碳流被阻斷；而在此條件下，突變株細胞的光合作用會受到嚴重的反饋抑制，光合效率極大降低；在過量表達藻株中，同時進行蔗糖合成酶的誘導性過量表達時，由于光合碳流重新獲得新的“出口”，工程藻株中光合作用的反饋抑制即可消除，而蔗糖合成效率得到2倍的提升[39]。近期，荷蘭代爾夫特理工大學的研究人員將相似策略用于乙醇細胞工廠的開發中，也取得了很好的效果，證明通過限制生物量積累來優化碳流的控制和分配在藍細菌光驅固碳細胞工廠開發中具有良好的應用前景[40]。

2.5 藍細菌產糖代謝工程策略展望

對微生物細胞工廠開發而言，代謝流的控制和優化是極為重要和有效的策略。增強碳流、能量流向目標代謝產物的分配，提高整條合成路線的原子經濟性是提高生物合成、生物煉制技術體系經濟競爭力的關鍵。然而，從代謝流的角度上看，目前合成水平較高的藍細菌蔗糖細胞工廠 (速生聚球藻UTEX 2973中過量表達蔗糖轉運蛋白CscB)，分配向蔗糖合成的光合碳流可以達到光合固碳總量的60%左右，用于細胞生物量合成的碳流比率只占40%左右；而在細胞生物量中可動員潛力較大的碳水化合物儲備-糖原合成占細胞干重比率一般在30%–50%之間，在光合固碳總量中占比則在5%–20%范圍內[32]。從這個角度看，對藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術而言，未來以進一步提升蔗糖合成水平、增強技術的可應用潛力為目標，其關鍵在于“開源”而非“節流”。僅僅通過碳源分配模式層面的優化，很難使蔗糖合成水平獲得質的提高，而且可能會影響細胞正常生長和代謝的魯棒性和適切性，以生長速度和光合活性降低為代價而片面強調目標產品碳流占比的提高，其結果往往是整個光驅固碳合成過程的效率的降低。藍細菌光驅固碳產糖技術合成水平的突破更應該著眼于整體提升藍細菌底盤藻株和工程藻株的光驅固碳效能，探索從根本上突破限制天然光合固碳系統效率和活性的機制性瓶頸，將蔗糖合成代謝網絡的“源頭加寬、池子挖深”，通過光合作用中固定的碳流的整體強化實現蔗糖產量的大幅提高。

3 基于藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術的人工合成光驅共生系統

3.1 人工合成光驅共生系統的概念驗證

如前所述，蔗糖分泌蛋白的導入推動了高效的藍細菌光驅固碳合成細胞工廠的成功開發，實現了基于光合微藻單一平臺的、由環境中的太陽能和二氧化碳向蔗糖的直接合成和分泌。然而，蔗糖的有效分泌也同樣提升了藍細菌工程藻株培養體系被異養微生物污染的風險。除了采用嚴格的生物污染控制策略、減少雜菌入侵和增殖概率的策略之外，模擬自然條件下地衣等自養-異養生物共生體系，將藍細菌產糖藻株和能以蔗糖為碳源的異養微生物細胞工廠共同培養，人工構建光驅共生合成系統以進行蔗糖的原位利用，成為另一種可行的選擇。

2012年，Ducat等向聚球藻PCC 7942導入基因，實現了鹽脅迫條件下蔗糖的合成和分泌后，首先探索了以藍細菌光驅固碳產糖系統支撐經典模式異養微生物——釀酒酵母生存和生長的可能性。研究人員首先證實，向培養聚球藻PCC 7942的BG11培養基中補充部分氮源和2%的蔗糖后，就可以用于釀酒酵母的培養；進而又發現，在產糖藍細菌藻株 (導入并誘導表達了基因的聚球藻PCC 7942) 的培養體系中，直接接種釀酒酵母，藍細菌細胞所合成并分泌的蔗糖可以維持酵母細胞生存并進行至少兩次分裂[9]。上述研究初步證實了以藍細菌光驅固碳產糖體系為基礎，維持人工合成共生體系運行的可行性。

3.2 人工光驅共生合成體系的開發和應用

Ducat實驗室進而探索了藍細菌光驅固碳合成蔗糖細胞工廠與3種經典的異養工業微生物 (大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母) 分別進行共培養的可行性[41]。研究結果表明，以藍細菌光驅固碳產糖為能量和物質基礎的共生體系能夠較為穩定地維持數周到數月的時間，而且面對不同的光照強度和光照節律表現出很強的魯棒性。共培養體系中，異養微生物的生長和代謝完全依賴于藍細菌合成并分泌的蔗糖，令人驚訝的是異養微生物的生長甚至可以反向促進藍細菌產糖細胞的光合固碳和生長，并因此進一步增強了共生系統的穩定性和魯棒性。如圖2所示，當使用進行了代謝工程改造的異養微生物細胞工廠替代其野生型菌株后，人工合成的光合共生系統還可以支撐高附加值化學品的生物合成 (枯草芽孢桿菌合成淀粉酶、大腸桿菌合成聚羥基丁酸酯)[41]。

近期，該研究組對藍細菌光驅固碳產糖支撐的人工合成共生體系進行了優化，主要內容是使用海藻酸鈉為基質對產糖藍細菌細胞進行包覆，這種包覆對藍細菌細胞的存活和產糖活性影響不大，卻能夠很大程度上限制細胞的復制，從而能夠使光合碳流更多定向于蔗糖的合成上，與浮游狀態的細胞相比，海藻酸鈉包覆的細胞蔗糖單位生產效率得到了2–3倍的提高[42]。將海藻酸鈉包覆的藍細菌產糖細胞與一種天然的PHB合成微生物——玻利維亞鹽單胞菌共培養，所形成的光驅共生系統對環境擾動和生物污染表現出極強的抵抗能力，可以在長達5個月的培養時間中維持整體生物量 (主要是) 和目標產品PHB的持續增長，在此期間不需要外源添加任何抗生素和其他選擇性策略。此外，與浮游的藍細菌細胞相比，海藻酸鈉包覆體與細胞在沉降系數上差異更大，意味著包含PHB的細胞生物量可以更便捷地從共生培養系統中進行選擇性采集。研究人員還證實這種海藻酸鈉包覆體同樣可以用于能夠合成PHB的大腸桿菌工程菌株共培養，表明這一策略具有較好的普適性[42]。

圖2 基于藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術的人工合成光驅共生系統的設計和工作原理

值得注意的是，以現有的藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術為基礎的人工合成光驅共生合成系統，要求所采用的異養微生物細胞工廠必須具備蔗糖的利用能力，而對于天然無法利用吸收-代謝蔗糖的微生物菌株則需要進行針對性改造。與前面介紹的其他異養微生物相比，具有很強的逆境脅迫耐受能力的惡臭假單胞菌對產糖藍細菌所用的培養基的適應性最好，只需要很小的營養補充，非常適合于共培養[43]。但是該菌無法利用蔗糖，Lowe等為了提高的蔗糖利用能力，向該菌中導入了系統，其中CscA能夠將胞外多糖水解為葡萄糖和果糖，而CscB則可以促進糖類的吸收，最終構建了可以進行PHB合成的人工合成光驅共生系統[43]。

3.3 人工光驅共生合成體系的概念擴展和機制研究

從設計上看，目前大多人工構建的光驅共生系統都是以單向支撐的，完全以藍細菌的光驅固碳合成蔗糖為系統維持運行的能量和物質供應基礎。近期，Smith等設計了一種雙向互通式共生系統，利用廣泛應用的產糖聚球藻藻株 (導入了的聚球藻PCC 7942) 和一種固碳微生物——棕色固氮菌，人工構建了一種新的互利型共生體[44]。在這個共生體系中，產糖藍細菌藻株在鹽脅迫條件下，利用光合作用固碳合成蔗糖并分泌至胞外，提供給棕色固氮菌有機碳源；而棕色固氮菌則利用蔗糖生長代謝，進而反向為產糖藍細菌提供有機氮源。與此前報道的人工光驅共生體系相比，這種雙向互利式光驅共生體可以在最基本的營養條件下自我維持，不需要額外添加任何有機氮源和碳源就可以進行有價值的代謝物的合成[44]。

藍細菌光驅固碳合成蔗糖細胞工廠和合成高附加值化學品的異養微生物細胞的共培養系統，是模擬自然條件下自養-異養生物共生體系而構建的人工合成共生模式[45]，實現從無機CO2向高附加值有機產物的全鏈條轉化。與單一平臺的合成模式相比 (直接在藍細菌中構建目標化學品的合成途徑)，這種共生系統通過將具備多樣化代謝和生理特性的不同微生物組分有機整合，對復雜的、涉及大量催化步驟的反應途徑造成的代謝和生理負擔進行分流和緩沖，有利于實現穩定、可持續的生物合成過程。雖然理論上，藍細菌光合作用固定的碳流中一大部分會被重新定向于共生的異養微生物生物量的積累，并因此造成可進行光合作用的細胞數量降低；但這種損失可以通過共生體系中，異養微生物代謝對藍細菌生長的“反哺”式有利作用來部分彌補。已有的研究表明，向微藻培養體系中接種來自其自然生長環境中的異養微生物能有效地促進微藻細胞的光合生長和代謝活性[46-47]；而在人工合成光驅共生體系的開發過程中也發現，與異養微生物 (包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母) 的共培養對藍細菌細胞光合生長有顯著的生長促進和脅迫保護作用[41,45]。關于這種促進和保護作用具體機制的解析仍處于探索階段。Li等在研究產蔗糖藍細菌和膠紅類酵母菌的共培養時發現，藍細菌在高密度培養下，其活躍的光合作用會導致培養體系中大量積累活性氧并導致藍細菌生長的抑制；而共培養的酵母細胞可以有效清除活性氧，減輕藍細菌的生理負擔并促進其生長[45]。在未來，為了實現光合自養微生物和異養微生物之間的最優平衡，需要進一步探索設計原則和有效調控方案，從而實現合成共生體內部的代謝互補和互利[48]。

4 總結和展望

全球范圍內，藍細菌通過高效的光合作用提供了生物圈內20%左右的有機碳源，是極為重要的初級生產力[49-50]。基于合成生物學和代謝工程技術發展，已經可以通過基因、蛋白、途徑層面上使這一過程集約化、可控化，以光能為驅動將光合自養細胞中二氧化碳和水直接轉化為含能有機分子。而光合生物制造技術的發展方向則是在此基礎上，實現大尺度時空范圍下，定制化的藍細菌和微藻細胞群體中，能量和物質的高效、高通量、定向轉化。藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術是一項具有代表性的光合生物制造技術，也是極具潛力的新型糖原料供應路線。相比較于傳統的“植物種植-生物質采集-原料預處理-糖類提取”的路線，“微藻培養-糖類合成”的技術模式過程簡單、產物明確，而且可以依托鹽堿地、灘涂等邊際土地進行工程應用，既“不與人爭糧”、又“不與糧爭地”，可以同時達到固碳減排和促進綠色生物經濟模式發展的效果。以目前的36 mg/(L?h)的蔗糖合成水平計算，如果在規模化培養體系下成功地等效放大，其估算效益可以達到每公頃土地年產蔗糖55噸的水平，遠遠超過同等種植面積的甘蔗的蔗糖生產能力，技術和模式的發展前景非常可觀[9]。然而，要真正推動藍細菌光驅固碳產糖技術的工程化、規模化應用，有待解決的問題還很多。

首先，藍細菌鹽脅迫響應型蔗糖合成的調控機制仍不清楚。目前，藍細菌蔗糖合成仍依賴于高濃度鹽脅迫，通過合成生物學和代謝工程改造來實現“非鹽脅迫型”蔗糖合成的設想尚未實現。這在一定程度上增加了光驅固碳產糖技術的復雜性和應用難度。從遺傳調控和生理生化角度上，揭示蔗糖合成途徑在“鹽脅迫”/“非鹽脅迫”兩種模式下的活動機制，進而重構調控模式，實現“人工控制信號”替代“鹽脅迫信號”進行蔗糖合成的誘導，將是簡化藍細菌光驅固碳產糖條件、提高該技術成熟度的重要發展方向。

其次，藍細菌底盤藻株和產糖工程藻株的逆境脅迫耐受性仍有待提高。與實驗室內理想而穩定的環境條件相比，微藻規模化培養中可能會遇到高溫、高光、高pH等脅迫因素；而產糖藻株的培養過程中，分泌到胞外的蔗糖進一步增加了生物污染的風險，為了控制、抑制生物污染而采取的各種選擇性策略和條件對藍細菌的魯棒性也提出了更高的要求。現階段，光驅固碳產糖細胞工廠普遍以集胞藻PCC 6803、聚球藻PCC 7942等模式藻株為底盤進行開發，其生理魯棒性和適切性難以滿足未來規模化培養環境的需求。篩選、開發具有更強逆境適應能力的底盤藻株，或者系統應用合成生物技術提升現有藻株的逆境適應能力，將是下一階段藍細菌產糖細胞工廠開發所必須考慮的方向[48]。

第三，藍細菌光驅固碳產糖體系中蔗糖的高效分離和采收技術研究仍是空白。如前所述，雖然通過開發人工合成光驅共生體系等策略可以在一定程度上解決分泌到胞外的蔗糖容易引發雜菌污染的問題，但著眼于未來更大規模、更廣范圍的光驅固碳合成糖類技術的開發應用，蔗糖為代表的糖類產品如何快速、有效地從培養體系中分離出來仍然是亟待解決的問題，強效的、特異性的樹脂吸附、膜分離技術的開發將有望為這一問題的解決提供助力。

未來，通過系統運用合成生物學、系統生物學、過程工程科學的策略和手段，深入解析藍細菌產糖的遺傳和代謝機制，解除太陽能驅動下胞內物質和能量向蔗糖轉化的機制性瓶頸，結合適配性的工藝和設備，光驅固碳產糖技術的開發和應用必將取得新的突破。

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Cyanobacteria based photosynthetic production of sucrose: development and prospect

Xintong Chi1,2, Shanshan Zhang2, Shaoming Mao1, Guodong Luan2, Quan Luo2, and Xuefeng Lü2

1 College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China 2 Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

Biorefinery technologies provide promising solutions to achieve sustainable development facing energy and environment crisis, while abundant sugar feedstock is an essential basis for biorefinery industries. Photosynthetic production of sucrose with cyanobacteria is an alternative sugar feedstock supply route with great potentials. Driven by solar energy, cyanobacteria photosynthetic cell factory could directly convert carbon dioxide and water into sucrose, and such a process could simultaneously reduce carbon emissions and supply sugar feedstocks. Here we introduced the history and updated the state-of-the-art on development of cyanobacteria cell factories for photosynthetic production of sucrose, summarized the progress and problems on mechanisms of sucrose synthesis, metabolic engineering strategies and technology expansions, and finally forecasted the future development direction in this area.

cyanobacteria, sucrose, photosynthesis, metabolic engineering, salt stress

January 14, 2019;

January 31, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31600034, 31770092), Key Scientific Research Projects of Education Department of Hunan Province (No. 15A198).

Shaoming Mao. Tel: +86-731-85623497, E-mail: msm526@163.com Guodong Luan. Tel: +86-532-80662711, Email: luangd@qibebt.ac.cn.

國家自然科學基金 (Nos. 31600034, 31770092)，湖南省教育廳科研重點項目 (No. 15A198) 資助。

2019-06-20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190620.1123.001.html

郗欣彤, 張杉杉, 毛紹名, 等. 藍細菌光驅固碳合成蔗糖技術的發展與展望. 生物工程學報, 2019, 35(8): 1411–1423.Chi XT, Zhang SS, Mao SM, et al. Cyanobacteria based photosynthetic production of sucrose: development and prospect. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1411–1423.

(本文責編 郝麗芳)