抑制AKT通路對埃克替尼耐藥的非小細胞肺癌細胞遷移能力的影響

楊旸，王一喆，鄭春雷，侯科佐，王曉楠，胡雪君

（中國醫科大學附屬第一醫院 1.呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科；2.腫瘤內科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點實驗室，沈陽 110001）

研究［1-2］顯示，肺癌是對人類健康威脅較大的惡性腫瘤之一，80%～85%的肺癌為非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）；NSCLC發 病 率及死亡率逐年攀升。NSCLC發現時往往已為晚期，失去了手術治療機會，靶向治療已成為晚期NSCLC治療的主要方法之一。以吉非替尼和厄洛替尼為代表的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）—酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）已成為EGFR突變型晚期NSCLC的一線治療藥物。EGFR-TKI類藥物明顯提高EGFR突變的NSCLC患者的生存率，但耐藥問題是阻礙患者療效的最大障礙［3］。肺癌的首要死因是腫瘤細胞侵襲周圍組織和遠處轉移［4］，近年來的研究［5］表明，NSCLC發生EGFR-TKI耐藥后更易發生遠處轉移。

既往研究［6］表明接受TKI治療的細胞耐藥后往往更容易發生轉移，耐藥細胞遷移能力增強與其上皮細胞間質化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）表型獲得相關，近期研究［7］表明耐藥細胞干性表型的增強促進其轉移及侵襲，但TKI耐藥細胞的轉移機制目前尚不十分明確。已有研究［8］表明AKT信號通路活化在介導EGFR激酶抑制劑耐藥性方面起關鍵作用，但其是否促進TKI耐藥細胞轉移并不十分清楚。埃克替尼是我國第一個擁有自主知識產權的EGFR-TKI，在晚期NLCLC治療領域發揮良好抗腫瘤作用，目前對于埃克替尼耐藥機制尚不十分清楚，2017年有研究［9］表明人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）水平降低可能與NSCLC細胞對埃克替尼敏感性降低相關，另有研究［10］表明卡斯塔斯B細胞淋巴瘤譜系B-b（casitas B cell lymphoma-b，CBL-b）低表達介導EGFR突變的NSCLC埃克替尼耐藥。本研究探討抑制AKT通路對埃克替尼耐藥的NSCLC細胞遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640 培養基（美國Gibco公司），EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT（美國Cell Signaling Technology公司），β-actin抗體（美國Santa Cruz公司），LY294002（美國Cell Signaling Technology公司），埃克替尼（浙江貝達藥業公司贈予，藥物粉末于DEMSO中溶解，貯存濃度為10 mmol/L，-20 ℃保存）。

1.2 細胞培養

人肺腺癌細胞株PC9購自中科院上海細胞庫，PC9細胞株于5%CO2、37 ℃恒溫箱內，在含10%胎牛血清（以色列Biological Industries公司）、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養液中培養，2～3 d傳代1次。所有實驗均采用對數生長期細胞。

1.3 耐藥系建立

PC9細胞持續暴露于初始濃度為0.05 μmoL/L的埃克替尼溶液中，并逐漸增加藥物濃度，直到藥物濃度達到10 μmoL/L。穩定存活于埃克替尼溶液（10 μmoL/L）中的細胞即為耐藥細胞（PC9/IcoR）。耐藥細胞培養條件：含10%胎牛血清（以色列Biological Industries公司）及1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養基置于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中，2～3 d傳代1次。

1.4 MTT法檢測細胞增殖能力

取對數生長期的PC9或PC9/IcoR細胞胰酶消化，以3 000/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養，待細胞貼壁后加入不同濃度的埃克替尼（0.1、1、10、20 μmoL/L），每種藥物濃度設置4個復孔，另設4個溶劑復孔作為對照，培養72 h后每孔加入20 μL MTT（5 g/L），繼續培養4 h后吸棄上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜，震蕩15 min。酶標儀檢測570 nm波長的吸光度值，計算抑制率。

1.5 Transwell法檢測細胞遷移能力

采用6.5 mm直徑、10 μm厚度、8 μm孔徑的聚碳酸酯多孔濾膜（24孔板Transwell小室）。將PC9或PC9/IcoR細胞（3.0×104個）懸浮于無血清RPMI1640培養液（200 μL）中，并種植在小室的上層。下室加入含2.5%血清RPMI1640培養液（500 μL）。埃克替尼、LY294002以及埃克替尼與LY294002聯用的耐藥細胞藥物預處理4 h，分別于上室及下室加入相應濃度的藥物。小室于37 ℃、5%CO2孵箱中培養24 h后，清洗并風干，小室膜用瑞士吉姆薩染色法染色固定1 h。清洗晾干后顯微鏡下觀察照相，每個小室隨機選取3個視野計數，實驗至少重復3次。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達

將細胞冰上裂解，超聲離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉印至硝酸纖維素膜上。5% 脫脂牛奶封閉1 h后分別加入稀釋好的1抗4 ℃環境過夜，1×PBS洗滌4次，加入二抗封閉40 min，1×PBS洗滌4次后ECL發光試劑盒顯色，凝膠成像系統照相，分析灰度值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。所得數據均為3次獨立實驗結果，采用±s表示。2組之間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 埃克替尼對PC9和PC9/IcoR細胞增殖能力影響

結果顯示，不同濃度（0、0.1、1、10、20 μmol/L）埃克替尼作用于PC9細胞 72 h，PC9細胞增殖抑制率分別為0、（15.02±3.14）%、（48.13±1.41）%、（64.89±0.96）%、（78.02±2.68）%；與對照組（0 μmol/L埃克替尼）比較，PC9細胞增殖明顯抑制（P＜ 0.05），其增殖抑制率隨濃度增加而升高。不同濃度（0、0.1、1、10、20 μmol/L）埃克替尼作用于PC9/IcoR 細胞72 h，PC9/IcoR細胞增殖抑制率分別為0、（2.96±0.32）%、（6.08±1.25）%、（9.19±0.83）%、（28.03±9.51）%；PC9/IcoR細胞增殖在不同濃度埃克替尼藥物作用下均未受到明顯影響（P＞ 0.05），提示PC9/IcoR細胞對埃克替尼的敏感性降低。

2.2 PC9和PC9/IcoR細胞遷移能力比較

結果顯示，穿過聚碳酸酯多孔濾膜的PC9細胞、PC9/IcoR細胞數量分別為132.67±14.57、234.33±22.28，2組比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）。與PC9細胞比較，耐藥細胞PC9/IcoR的遷移能力明顯增強。見圖1。

圖1 PC9細胞和PC9/IcoR細胞遷移能力的比較 瑞氏吉姆薩法×200Fig.1 Comparison of the migration ability between PC9 cells and PC9/IcoR cell Giemsa staining×200

2.3 PC9和PC9/IcoR細胞中相關蛋白表達

Western blotting結果顯示，與PC9細胞比較，耐藥細胞PC9/IcoR中EGFR和AKT的磷酸化水平均明顯升高，提示AKT通路活化可能使耐藥細胞遷移能力增強（圖2）。

圖2 PC9細胞和PC9/IcoR細胞的蛋白表達Fig.2 Protein expression of PC9 cells and PC9/IcoR cells

2.4 LY294002對PC9/IcoR細胞AKT通路的影響

AKT通路抑制劑LY294002（20 μmol/L）作用于PC9/IcoR細胞24 h后，AKT磷酸化水平明顯降低；LY294002與埃克替尼（20 μmol/L）聯合作用24 h后，AKT通路抑制最明顯（圖3）。提示20 μmol/L LY294002可顯著抑制PC9/IcoR細胞的AKT活化。

圖3 抑制AKT對PC9/IcoR細胞蛋白表達影響Fig.3 Protein expression of PC9/IcoR cells after inhibiting AKT

2.5 抑制AKT通路對PC9/IcoR細胞遷移能力的影響

為探討AKT活化在PC9/IcoR轉移中的作用，AKT通路抑制劑LY294002（20 μmol/L）單獨或與埃克替尼（10 μmol/L）聯合作用PC9/IcoR細胞24 h后，Transwell法檢測細胞遷移能力。結果顯示，對照組（單純PC9/IcoR細胞）、埃克替尼組（埃克替尼+PC9/IcoR細 胞）、LY294002組（LY294002+PC9/IcoR細胞）、埃克替尼+ LY294002組（埃克替尼+LY294002+PC9/IcoR細胞）細胞遷移數量分別為234.05±22.61、200.33±20.08、90.45±18.88、19.67±6.42。與對照組比較，埃克替尼組對細胞遷移能力沒有明顯影響（P＞0.05）；LY294002組可明顯抑制細胞遷移能力（P＜0.05）；埃克替尼+ LY294002組對細胞遷移能力的抑制作用更明顯（P＜ 0.05）。提示AKT通路活化使PC9/IcoR細胞的遷移能力增強。見圖4。

3 討論

腫瘤轉移是一個非常復雜的過程，關于耐藥腫瘤細胞的轉移機制至今知之甚少，可能與腫瘤微環境改變、細胞內與細胞質基質之間的相互作用、細胞間黏附缺失及腫瘤細胞耐藥后干性表型增強有關［11-13］。NSCLC接受EGFR-TKI治療后發生獲得性耐藥的細胞系轉移及侵襲能力均增強，而且更易獲得EMT表型［14］。本研究結果顯示，與PC9親本細胞比較，PC9/IcoR耐藥細胞遷移能力明顯增強，提示腫瘤細胞的侵襲及遠處轉移是埃克替尼耐藥的特征之一。

圖4 抑制AKT對PC9/IcoR細胞遷移能力影響 瑞氏吉姆薩法×200Fig.4 Effect of AKT inhibition on the migration ablity of PC9/IcoR cells Giemsa staining×200

PI3K/AKT通路在細胞生長、分化、增殖和轉移中發揮不可替代的作用。研究［15］表明，AKT通路活化促進腫瘤細胞侵襲和轉移。已有研究［16］顯示PI3K/AKT信號通路在乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤的侵襲和轉移中均被活化。PI3K/AKT信號通路抑制劑可以抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲。AKT通路在不同類型的TKI，包括EGFR-TKI的阻力中發揮至關重要的作用。MET擴增、HGF產生和PIK3CA突變均可以阻斷TKI類介導的AKT抑制，進而產生EGFR-TKI耐藥。在NSCLC中，PI3K/AKT通路異常活化是EGFR-TKI獲得性耐藥的原因之一［17］，在肝癌中PI3K/AKT通路活化介導索拉非尼耐藥［18］。單獨使用AKT通路抑制劑或與吉非替尼聯用已證明可以在體外和體內克服HGF介導的吉非替尼耐藥［19］。本研究結果顯示，與PC9親本細胞系比較，PC9/IcoR耐藥細胞系中EGFR、AKT等蛋白活化水平明顯升高，這一現象與耐藥細胞系遷移能力增強變化趨勢一致，提示AKT活化可能與遷移相關。用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用于PC9/IcoR耐藥細胞系后，AKT通路活性被抑制同時耐藥細胞遷移能力明顯降低，且AKT通路抑制劑LY294002聯用埃克替尼后PC9/IcoR細胞系遷移能力幾乎完全抑制。這些結果均說明阻斷AKT信號通路可以逆轉埃克替尼耐藥細胞的遷移。

綜上所述，AKT活化促進PC9/IcoR耐藥細胞遷移，抑制AKT通路活性可以抑制埃克替尼耐藥的NSCLC細胞的遷移。本研究僅從促進耐藥細胞遷移角度闡述AKT通路的作用，并未探討AKT通路活化對PC9/IcoR耐藥細胞增殖、凋亡等方面的作用。關于AKT信號通路在埃克替尼耐藥的NSCLC中促進遷移的具體機制、AKT通路對耐藥細胞增殖、凋亡等方面的影響以及抑制AKT通路能否逆轉埃克替尼耐藥將在今后的研究中進一步論證。