中職“納豆芽孢桿菌發(fā)酵納豆制品”實驗教學*

祁惠芳 程子良 牛亞勝 孔維寶**

（1西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州 730070 2天水農(nóng)業(yè)學校 甘肅天水 741400）

1 實驗設計思路

近年來，涉農(nóng)類中職學校為突出學生的實訓操作，開設了《生物應用技術(shù)》課程，該課程以就業(yè)為導向，注重學生技術(shù)技能的培養(yǎng)。然而，目前大多數(shù)學校使用的教材，均參考以義務教育為基礎的教材，涉及的實驗內(nèi)容大多以生物學基礎研究為主，例如顯微鏡觀察細胞結(jié)構(gòu)、探究光合作用條件、觀察玉米糯性和非糯性花粉粒遇碘的顏色變化實驗等，未能體現(xiàn)與職業(yè)教育導向相關(guān)的應用知識的學習。因此，教學內(nèi)容與實際生活脫軌，導致中職學生這一特殊群體對學習的生物學興趣不高。

為了在教學中讓中職學生掌握扎實的微生物學無菌操作知識，且與未來就業(yè)接軌，筆者以“納豆芽孢桿菌發(fā)酵納豆制品”實驗作為教學內(nèi)容，提高學生學習《生物應用技術(shù)》課程的興趣，巧妙地使學生掌握原本枯燥的無菌操作、培養(yǎng)基制作、菌種活化、發(fā)酵制品制作等相關(guān)的理論知識和實踐技能，增加學習過程的趣味性。該實驗以納豆為原材料，綠色環(huán)保、容易獲取、營養(yǎng)豐富，且實驗過程操作簡單、可操作性強、易于學生掌握。發(fā)酵后的產(chǎn)品可將大豆中不溶解性蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘鞍撞a(chǎn)生氨基酸，同時成品具有預防腸道疾病、骨質(zhì)疏松及溶膠血栓的作用［1］。

教育與實踐行動相結(jié)合，既能激發(fā)中職學生的實驗興趣，真正做到在“做事里求學問”［2］，又能讓學生獲得成就感與滿足感。中職學校的核心任務是培養(yǎng)滿足社會發(fā)展和企業(yè)需求的專業(yè)化應用型技能人才。學習納豆的制作方法其實是掌握了一項職業(yè)技能，可增加學生未來就業(yè)競爭力，一定程度上緩解中職學校重理論教學、輕實踐操作的問題，真正掌握生產(chǎn)實踐過程中所需的專業(yè)職業(yè)技能。因此，本實驗是中職學生實驗教學的理想內(nèi)容之一。

2 實驗教學內(nèi)容

本次實驗教學分4課時完成。課程開始前，教師根據(jù)全班學生情況進行分組，每組6人，小組成員各自擅長之處不同，組內(nèi)不設置小組長，完成任務靠小組成員共同討論。教師給各小組分發(fā)實驗流程單和實驗報告單。第1課時：納豆成品展示與芽孢桿菌菌種活化實驗。教師展示成品納豆并讓學生品嘗，指導學生進行菌種活化實驗；主要目的是使學生掌握無菌操作技術(shù)、培養(yǎng)基和種子液的制作方法；這部分實驗步驟較多，對學生的操作細節(jié)的要求較嚴格，要求各小組學生對實驗操作進行錄像，用于后續(xù)討論。第2課時：制作納豆。主要目的是培養(yǎng)學生專業(yè)職業(yè)技能，在納豆制作的過程中加深對生物基本操作的認識，掌握納豆制作工藝。第3課時：納豆成品的感官評定與理化指標檢驗。主要目的是判斷學生制作的納豆是否達到SB／T 10528-2009納豆商業(yè)標準，是否可食用。第4課時，成果展示并全班評價。各小組學生展示成果和播放錄像，講解實驗細節(jié)和目的。

2.1 實驗材料與儀器

1）材料與試劑：黃豆、納豆芽孢桿菌（Bacillusnatto）、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、0.01 mol／L 和6 mol／L NaOH、0.01 mol／L 和 6 mol／L HCl、海沙。

2）儀器與器具：PYL-45恒溫水浴鍋、高速離心機、恒溫振蕩器、SW-CJ-2FD超凈臺、YXQLS-7 5SII立式蒸汽滅菌鍋、冰箱、移液器、真空干燥箱、pH試紙、培養(yǎng)皿、試管、三角瓶。

2.2 實驗操作流程 本次實驗操作流程主要分為3個部分：第1部分，納豆芽孢桿菌菌種活化與種子液的制備；第2部分，納豆的制作過程（圖1）；第3部分，納豆成品的感官評定及理化指標測定。

表 1 感官評定［5］與理化指標標準［6］

圖1 納豆的制作流程

2.2.1 納豆芽孢桿菌種活化 按照培養(yǎng)基的配方配制培養(yǎng)基：蛋白胨 1%、牛肉膏 0.3%、NaCl 0.5%、葡萄糖 0.5%、酵母膏 0.5%、瓊脂粉 1.8%（以上均為質(zhì)量分數(shù)）［3］。待培養(yǎng)基滅菌并冷卻至42℃時，倒平板；將保存的納豆芽孢桿菌接種至培養(yǎng)基中。納豆芽孢桿菌活化完成后，使用接種環(huán)刮下菌孢并用無菌水沖洗，接入裝有一定量液體培養(yǎng)基的試管中；在30℃條件下，180 r／min搖床培養(yǎng)24 h制得種子液。

2.2.2 納豆成品制作 將大豆清洗干凈后，用水浸泡8～15 h，直至大豆體積膨脹為原來的2倍。將泡好的大豆在121°C條件下，進行高溫高壓滅菌15 min，大豆在手中可捏碎為最佳；然后在無菌環(huán)境下將滅菌的大豆移入發(fā)酵籠屜中冷卻，冷卻時表面需覆一層紗布；冷卻至室溫后，將準備好的種子液按8%～10%接種量淋至大豆表面，用無菌鏟攪拌均勻；將接種的大豆置于42℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15～18 h，進行發(fā)酵。發(fā)酵完成后，揭去籠屜表面的紗布，豆子將呈現(xiàn)灰白色，略有納豆的清香；最后將發(fā)酵的納豆置于4℃的冰箱中后熟24 h。

2.2.3 納豆成品感官評定和理化指標測定

1）感官評定。表1所示的是現(xiàn)行有效的SB／T 10528-2009對納豆的感官評定標準；使用目測、口嘗及嗅覺等方式對納豆制品進行感官評定；學生以小組為單位分別對不同組別的成品進行打分，判斷是否符合標準［4］（表 1）。

2）理化指標測定。

水分測定：按照GB／T 5009.3要求，利用減壓干燥法，使用已恒重的稱量瓶稱取10 g試樣并用刀片切碎，置于真空干燥箱內(nèi)，干燥箱連接水泵。將干燥箱的空氣抽出，壓力控制在40～53 kPa，溫度加熱至（60±5）℃。關(guān)閉真空泵上的活塞，停止抽氣，經(jīng)4 h后，打開活塞使空氣緩緩進入干燥箱，待壓力恢復正常后再打開，取出稱量瓶，放入干燥器0.5 h后稱量，重復以上操作至恒重。按照下述公式計算水分含量，含量；m1：稱量瓶和試樣的質(zhì)量；m2：稱量瓶和試樣干燥后的質(zhì)量；m3：稱量瓶的質(zhì)量），結(jié)果與表1的標準范圍進行比較，判斷是否符合食用要求［5］。

氨基酸態(tài)氮：按照GB／T 5009.39要求，利用甲醛值法測定氨基酸態(tài)氮值。將樣品粉碎研磨后吸取5 mL試樣于100 mL容量瓶中定容；混勻后吸取20 mL至于200 mL燒杯中，加60 mL水，開動磁力攪拌器，用0.05 mol／L NaOH滴定至酸度計指示pH值為8.2，記錄NaOH滴定體積；然后加入10 mL甲醛溶液混勻，繼續(xù)用 0.05 mol／L NaOH滴定至酸度計指示pH值為9.2，記錄消耗的 NaOH 體積；取 80 mL水，用 0.05 mol／L NaOH調(diào)節(jié)pH值為9.2，同時做試劑空白對照。使用下述公式計算氨基酸態(tài)氮，100%（X：試樣中氨基酸態(tài)氮含量；V1：試樣稀釋液消耗NaOH的滴定體積；V2：空白試驗消耗NaOH的滴定體積；V3：試樣稀釋液取用量；c：NaOH標準滴定溶液濃度）。計算結(jié)果與表1進行比較，判斷是否符合標準［6］。

2.2.4 實驗操作要點

1）蛋白胨易吸收水份，在稱量時用玻璃棒快速挑取，用熱水攪拌融化后放入燒杯。

2）每次調(diào)節(jié)較小幅度的pH值，以免回調(diào)影響培養(yǎng)基內(nèi)的離子濃度，直至pH值范圍控制在7.4～7.6內(nèi)。

3）使用蒸汽滅菌鍋將制作好的培養(yǎng)基在壓強0.1 MPa、溫度121℃條件下，滅菌20 min。

4）種子液接種至大豆表面時，一定要在無菌環(huán)境下操作，防止雜菌污染。

5）浸泡大豆時，每隔3 h更換浸泡水，防止大豆進行無氧呼吸產(chǎn)生酸味。

6）大豆的蒸煮程度以用手可輕輕捏碎為最佳。研究表明，隨著碾碎程度的加大，氨基酸態(tài)氮和粘多糖含量顯著增加［7］，可使大豆發(fā)酵更加充分。

7）將種子液接種至大豆后，在 42℃下發(fā)酵15～18 h，然后4℃后熟24 h。若過度發(fā)酵，會破壞納豆芽孢桿菌結(jié)構(gòu)，且容易引起其他雜菌滋生。

2.3 實驗報告單 教師將實驗原理設計成探究性問題，并制作實驗報告單分發(fā)給學生，待實驗完成后進行回收。旨在培養(yǎng)學生獨立思考的能力，學生通過實驗操作與現(xiàn)象觀察，明白實驗原理和理解實驗操作要點。實驗報告單如表2所示。

表2 “納豆芽孢桿菌發(fā)酵納豆制品”實驗報告單

2.4 實驗結(jié)果討論 整個實驗流程較簡單，只要嚴格遵照操作步驟，注意實驗操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行實驗操作即可，全程一定要明確無菌操作意識。學生針對自己小組出現(xiàn)的問題認真思考，展開討論，部分小組制作的納豆成品由于制作過程中雜菌滋生導致氨味過于強烈；有些小組制作的納豆有惡臭味，主要原因是在大豆浸泡過程中沒有及時更換浸泡水；個別小組的成品雖然表面粘稠品相很好，但口味略發(fā)苦，導致這種不良氣味產(chǎn)生的原因主要是大豆在發(fā)酵時透氣性不好，因此發(fā)酵時一定要在保證適宜濕度的前提下合理通風。

3 實驗教學總結(jié)

本次實驗的靈感來自于中職 《生物應用技術(shù)》，實驗利用納豆芽孢桿菌制作納豆，培養(yǎng)學生學習生物學實驗的興趣，鍛煉專業(yè)職業(yè)技能。該實驗使學生初步了解并學習了無菌操作技術(shù)、微生物純化、培養(yǎng)基制備、種子液配制、發(fā)酵條件控制、產(chǎn)品質(zhì)量檢測等實驗技術(shù)，同時讓學生掌握納豆的制作工藝，為后續(xù)開展生物學應用技術(shù)課程的學習奠定基礎。

生物學是一門實驗科學，對學生的實驗技能要求較高，實驗教學方式不應該是教師 “講解”，學生被動“接受”［3］。第4課時加入視頻展示和評價環(huán)節(jié)，其實是讓學生在“做中學”，觀看自己的實驗，可清楚地看到實驗中錯誤的操作。微生物操作技術(shù)對于實驗操作要求十分嚴格，每個操作要點都應該熟記于心，不小心雜菌侵染可能會導致整個實驗失敗，因此教師和全體學生共同評價，有助于學生對實驗細節(jié)的把控更加完善，扎實掌握微生物實踐技能。然而，單純地掌握技能是不夠的，還需要學生在工作實踐中靈活應用，不斷強化職業(yè)技能，為未來的就業(yè)提升競爭力。當下將微生物應用在食品、制藥和生物領(lǐng)域十分廣泛，本節(jié)實驗就是微生物在食品行業(yè)的應用，教學開始時讓學生品嘗納豆成品，從味道微甜、口感粘稠的納豆中激發(fā)學生的求知欲，納豆為什么表面會抽絲？味道為什么會發(fā)甜？什么菌種發(fā)酵才能達到這種效果？充分發(fā)揮學生的自主性、主動性和創(chuàng)造性，在學習知識、掌握職業(yè)技能的同時，培養(yǎng)學生的生物學學科核心素養(yǎng)。