響應面優化百里香多糖提取工藝及其抗氧化作用

王娣，李雨晴，程柏，李妍，曹珂珂

(蚌埠學院 食品與生物工程學院，安徽 蚌埠 233030)

百里香是由國際標準組織公布的香辛料之一，廣泛分布于非洲北部、歐洲及亞洲溫帶，百里香屬唇形科植物，有很強的芳香氣味，有消炎、防腐等作用[1]。全世界百里香屬植物大約有300～400種，我國百里香屬植物主要分布于西北，資源較為豐富[2]。百里香中含有豐富的活性成分，例如黃酮、多酚和多糖等，具有一定開發前景[3]。植物多糖具有生物活性，具體包括免疫調節、抗腫瘤、降血糖、降血脂等保健作用，越來越受到專家的關注[4-9]。本文采用超聲波輔助堿水法從百里香全草中提取多糖，以提取pH、料液比、提取時間為影響因素，進行響應面優化試驗，并對提取的多糖進行抗氧化活性研究，以期為我國百里香資源的進一步開發利用提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

百里香全草(Thymusmongolicus)：購于陜西省吳起縣，自然風干，置于陰涼干燥處避光儲存備用。

1.2 試劑

葡萄糖標準品、Vc標準品：購自國藥集團化學試劑有限公司；H2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4、C2H5OH、H2O2、FeSO4、C7H6O3等：均為分析純，購自天津市永大化學試劑有限公司。

1.3 試驗儀器

LD-T300A高速萬能粉碎機 上海頂帥電器有限公司；SK-1漩渦振蕩器 金壇市白塔新寶儀器廠；KDC-160HR高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；SB-3200DTD超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；XMA-600電熱鼓風干燥箱 余姚市亞泰儀表有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 百里香的預處理

百里香干燥粉碎后過60目篩，脫脂后于棕色瓶中低溫保存備用。

1.4.2 多糖測定方法

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品來計算多糖的提取率。

1.4.3 葡萄糖標準曲線的繪制

1 mg/mL葡萄糖標準液的制備：先將葡萄糖在60 ℃的條件下干燥至恒重，然后精確稱取葡萄糖0.100 g，加超純水溶解于100 mL的容量瓶中，定容，搖勻。分別吸取0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL標準液于10 mL容量瓶中，用超純水定容，搖勻。吸取1.0 mL不同濃度的葡萄糖溶液置于試管中，加入80%苯酚溶液50 μL，然后加入5 mL的濃硫酸溶液，混勻后靜置5 min，以超純水作為對照，在490 nm處下測定反應液吸光度，每個樣品平行試驗3次，取平均值，并且用葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制出標準曲線。

1.4.4 百里香多糖的提取方法

稱取一定量的百里香，超聲波300 W，50 ℃恒定條件下，在一定pH下提取一定時間，4000 r/min下離心10 min，得上清液，用苯酚-硫酸法檢測百里香多糖的提取率。

1.4.5 單因素試驗

1.4.5.1 提取時間對百里香多糖提取率的影響

稱取0.50 g百里香5份，加入20.0 mL超純水，用緩沖溶液調pH為10.0。在超聲波300 W、50 ℃恒定條件下提取5，10，15，20，25 min，4000 r/min下離心10 min，檢測得到百里香多糖的提取率。

1.4.5.2 料液比對百里香多糖提取率的影響

稱取0.50 g百里香5份，分別加入10，15，20，25，30 mL超純水，用緩沖溶液調pH為10.0。在超聲波300 W、50 ℃恒定條件下提取10 min，4000 r/min離心10 min，檢測得到百里香多糖的提取率。

1.4.5.3 pH對百里香多糖提取率的影響

稱取0.50 g百里香5份，按照1∶40的料液比，用緩沖溶液調pH為10.0，11.0，12.0，13.0，14.0。在超聲波300 W、50 ℃恒定條件下提取10 min，4000 r/min下離心10 min，檢測得到百里香多糖的提取率。

1.4.6 響應面優化試驗

以提取液中百里香酚的含量作為考察指標進行分析，試驗因素及水平編碼見2.3.1中表1。以提取pH、料液比、時間為考察因素，選取合適的因素水平，采用Box-Behnken設計四因素三水平回歸試驗，使用Design Expert 8.0軟件進行響應面優化試驗設計及結果分析。

1.4.7 百里香多糖的抗氧化作用研究

1.4.7.1 百里香多糖純化

將百里香多糖提取液加入50%乙醇，4 ℃靜置12 h，抽濾，取濾液,再加入70%乙醇，放置于冰箱中，4 ℃靜置12 h，抽濾，取濾液，用丙酮與濾液(4∶1)充分震蕩，靜置，取下層液，濃縮后冷凍干燥，得純化多糖[10]。

1.4.7.2 清除DPPH自由基能力的測定[11,12]

將純化后的百里香多糖，配制成質量濃度分別為0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mg/mL的百里香多糖溶液后，分別取2 mL上述濃度的多糖溶液放入6支試管中，再分別加入2.0 mL質量濃度為0.2 mmol/L DPPH溶液，避光靜置30 min后，在517 nm處測得其吸光度數值，用Vc作為對照。DPPH自由基的清除率計算公式為：

清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%。

式中：A0為未加樣品時DPPH溶液的吸光值；A1為樣品溶液的吸光值；A2為加入樣品后DPPH溶液的吸光值。

1.4.7.3 清除OH自由基能力的測定[13,14]

將超聲波提取的百里香多糖冷凍干燥成粉狀，配制成質量濃度分別為1，2，3，4，5，6，8，10 mg/mL的百里香多糖溶液，分別加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L 乙醇-水楊酸，加入適量的超純水，最后加入8 mmol/L H2O2后混勻，在510 nm下測定其吸光度，用Vc作為對照。OH自由基清除率計算公式為：

清除率=[A0-(AX-AX0)]/A0×100%。

式中：A0為空白對照的吸光度數值，AX為加樣品的吸光度數值，AX0為不加H2O2的吸光度數值。

2 試驗結果與分析

2.1 苯酚-硫酸法標準曲線

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，標準曲線方程為y=3.752x+0.0102(R2=0.9999)，在0.05～0.25 mg/mL范圍內時，葡萄糖濃度與吸光度呈現出良好的線性關系。

2.2 百里香多糖提取單因素試驗結果

2.2.1 提取時間對百里香多糖提取率的影響

圖2 提取時間對百里香多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extracion rate of thyme polysaccharides

由圖2可知，百里香多糖提取率隨提取時間的增加先上升再下降，當提取時間在10 min時，百里香多糖的提取率最大，10 min后，百里香多糖的提取率開始明顯下降，可能是提取時間過長破壞了產物的結構。綜合考慮，提取時間10 min為最適提取時間。

2.2.2 料液比對百里香多糖提取率的影響

圖3 料液比對百里香多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate of thyme polysaccharides

由圖3可知，料液比由1∶20增至1∶40時，多糖提取率逐漸增加，隨后隨著料液比再增加，百里香多糖的提取率反而開始下降。綜合考慮，百里香多糖提取料液比為1∶40時最適宜。

2.2.3 pH對百里香多糖提取率的影響

圖4 pH對百里香多糖提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the extraction rate of thyme polysaccharides

由圖4可知，隨著pH的不斷增大，百里香多糖的提取率不斷升高并逐漸趨于平穩，綜合考慮，選擇pH 13為百里香多糖提取的最適pH。

2.3 響應面優化試驗結果分析

2.3.1 響應面優化分析

試驗設計因素編碼、水平及結果見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

注：表中百里香酚提取率為均值(N=3)。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

以百里香多糖提取率為考察指標，提取時間、料液比、pH為自變量，回歸擬合后得到多糖提取率的回歸方程式模型為：Y=5.36+0.15A+0.22B+0.31C-0.58A2-0.85B2-0.39C2-0.053AB-0.09AC+0.077BC。

由表3方差分析可知模型的P<0.0001，表明該模型方差極顯著。實驗結果顯示提取時間、提取pH對百里香多糖提取的影響極顯著，料液比的影響顯著，二次項A2、B2、C2是極顯著的，R2=99.21%表明回歸方程能較好地描述各單因素與響應值之間的關系。根據二次回歸方程的系數絕對值的大小C>B>A，可判斷3個因素對多糖提取率的影響大小為：pH對百里香多糖提取率的影響效果最為顯著，然后依次為提取時間、料液比。通過軟件分析得到超聲提取百里香多糖的最佳工藝條件：提取時間為10.5 min，料液比為1∶40.8，pH為13.4，提取率為5.45%。

2.3.2 三維曲面圖

響應面圖能直觀地反映出各個因素間的交互作用，通過多元回歸方程做響應面圖，見圖5。

A料液比與時間

B料液比與pH

C時間與pH

由圖5可知，3個響應曲面均為開口向下的凸形曲面，同時等高線最小橢圓的中心在所選的-1～1范圍內，說明響應值(百里香多糖提取率)在3個因素設計的范圍內存在最大值。由圖5A可知，在一定的提取時間內，百里香多糖提取率隨著料液比的增大而增大，但達到一定程度后，多糖提取率呈現下降趨勢。由圖5B可知，多糖的提取率隨著pH和料液比的增加先增大后減少。由圖5C可知，多糖提取率隨著pH與提取時間的增加先增加后減少。由圖5B和圖5C等高線可以看出，等高線的橢圓形較明顯，從而證明了料液比與pH、提取時間與pH這兩組因素的交互作用顯著。

2.3.3 響應面優化結論驗證

由響應面法分析得到的百里香多糖提取的最佳工藝條件：提取時間為10.5 min，料液比為1∶40.8，pH為13.4，在該條件下進行驗證試驗，平行3次，最終得率為5.45%。

2.4 百里香多糖抗氧化作用的結果與分析

2.4.1 清除DPPH自由基能力的測定

圖6 百里香多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of thyme polysaccharides on DPPH free radicals

由圖6可知，隨著百里香多糖濃度的增加，對DPPH自由基的清除率不斷提高，當百里香多糖的濃度為1.2 mg/mL時達到了最高值58%，但是與Vc的DPPH清除能力比較略低。

2.4.2 百里香多糖對OH自由基的清除作用

圖7 百里香多糖對OH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of thyme polysaccharides on OH free radicals

由圖7可知，隨著百里香多糖濃度的增加，對羥基自由基的清除能力穩定增強，當百里香多糖濃度超過8.0 mg/mL后，對羥基自由基的清除能力趨于穩定。百里香多糖的濃度為10 mg/mL時，清除率最高，為39.74%。相比等量Vc的OH自由基清除能力，比百里香多糖對羥基自由基的清除能力高。

3 結論

采用超聲波輔助堿水提取百里香多糖過程中，pH對百里香多糖提取率的影響效果最為顯著，然后依次為提取時間、料液比。響應面優化得知百里香多糖最佳的提取工藝條件：提取時間為10.5 min，料液比為1∶40.8，pH為13.4，百里香多糖的提取率為5.45%；抗氧化試驗結果表明百里香多糖具有一定的抗氧化活性，試驗結果表明，百里香多糖的濃度為1.2 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為58%；百里香多糖的濃度為10 mg/mL時，對OH自由基的清除率為39.74%，但與等濃度Vc相比抗氧化作用略低，有待進一步研究。