微調可使CRISPR準確度提高50倍

編譯 凌寒

CRISPR可能是首個有望顛覆天然基因組、消除遺傳疾病的基因編輯成果。但從一開始，就有一道難題擺在面前：準確性。

早在2017年，一份報告因使用CRISPR技術而充滿爭議：因為在小鼠身上發現了大量脫靶的編輯，基因編輯工具肆意地剪切了無辜的基因。這項研究遭到了強烈的駁斥，并最終被撤回，但人們對這種強大工具的脫靶問題的擔憂并沒有消失。即使相對準確的CRISPR替代版本，最近也因為其在DNA和RNA中引起數百個意想不到的突變而飽受爭議。

如果不能確保精準性，任何已提出的CRISPR基因治療都將淪為“擲骰子”行為。

現在，來自杜克大學的一個團隊可能已經開發了一個通用的解決方案：能從根本上提高幾乎所有形式的CRISPR準確性——微調了向導RNA。向導RNA是CRISPR兩個組成中不可或缺的組分，發揮著類似“偵探獵犬”的作用，它能在其合作伙伴Cas對特定DNA序列進行切割前瞄準好待修改的序列。該項研究于近期發表在《自然-生物技術》雜志上。

如何微調？將一種“鎖定”結構標記到向導RNA的一端，這樣只有靶標DNA才能激活Cas施展“剪刀”功能。然而，正是因為這個微調如此簡單，向導RNA 2.0可以從根本上提高多個CRISPR系統的準確性，甚至高達200倍。這樣的微調，不僅對那些依賴經典Cas9的系統有效，同樣也對依賴Cas12a及其他新型剪切系統有效。

這并不是增量調整。相反，這一調整策略與以往為提高CRISPR準確度所作的努力截然不同，以往常致力于尋找新的、更好版本的Cas剪刀。

“我們所關注的解決方案，它不會增加更多的部件，而且能夠適用于任何一種CRISPR系統。”研究報告的作者杜蘭·寇卡科（Dewran Kocak）說。

“這是一個相當不錯的、簡潔的、可以杜絕脫靶現象的解決方案。”第一作者查爾斯·格斯巴赫（Charles Gersbach）博士補充說。

你好，我是向導RNA

為什么改變分子偵探獵犬能從根本上提高CRISPR編輯的準確性？

回溯歷史，RNA結構的變化所發揮的作用不容忽視。例如，榮獲了諾貝爾獎的基因沉默技術（RNAi）花了數十年時間才得以揭示，對靶向RNA的微小調整可以大幅度減弱免疫應答或提高效率和準確性。

RNAi等來之不易的經驗教訓啟發著基因編輯。當我們在描述CRISPR的過程時，通常都是這么說的：向導RNA——長得像一條蠕蟲似的——包含與靶標DNA匹配的字母序列。當這二者結合時，會遵循嚴格的配對規則，即A與T*結合，C與G結合，之后向導RNA將Cas剪刀拖過來，在預定的位置進行DNA剪切。（*更準確地說， DNA中是“T”， RNA中是“U”。）

不幸的是，在生物學中，理論往往與現實不符。事實上，向導RNA看起來就像很多片被串在一起的三葉草葉子，里面塞滿了被稱之為“莖環結構”（stem-loops）的突起，這使得它的結構穩定，結合效率最大化。總的來說，大多數向導RNA只包含20個左右的堿基。在人類浩如煙海約60億個DNA堿基中，錯配率相當高。

這就是為什么設計向導RNA既是一門科學也是一門藝術的部分原因。與尤達的著名格言“要么做要么不做，沒有嘗試這一說”不同，科學家們通常需要反復修改他們設計的特定向導RNA序列，才能使其正常工作。

盡管如此，CRISPR一直都有一本向導RNA工程設計指南——一種通用的原型設計，可適用于大多數的CRISPR應用程序。

一切都與能量有關

研究小組的靈感來自于細胞需要能量。

正如任何其他生物事件一樣，向導RNA與DNA結合并釋放Cas是需要能量的。之前的研究發現，向導RNA與DNA匹配得越精確，兩者就越容易形成所謂的“R環”（一種啟動了整個切割程序的分子雜交體）。

該團隊的絕妙想法是在向導RNA的尾端添加一個額外的三葉草狀結構。這種“發夾結構”（hairpin）在很多情況下就像一個實體塊，除非向導RNA與靶標DNA匹配，否則它龐大的結構就會阻止RNA與DNA配對形成R環。無法形成R環，就不會發生切割，就能保證非靶標DNA序列的安全。但是，如果序列確實匹配的話，向導RNA就會與其相匹配的DNA形成R環，撕開發夾結構，這反過來會激發Cas剪刀行動。

該團隊在計算機模擬技術的指導下，設計了一系列的攜帶發夾結構的向導RNA或稱“hp-sgRNAs”，在人類細胞中進行了試驗。當與經典的Cas9配對時，新型分子偵探獵犬的靶標特異性提升了大約50倍。在一項觀察細胞基因組中脫靶效應的敏感實驗中，研究小組發現，與經典的向導RNA相比，他們的升級版本減少了124個脫靶位點，且沒有產生任何新的脫靶位點。

與它結合的Cas剪刀的效用一樣令人印象深刻，其中許多剪刀在結構和功能上與Cas9僅有微弱的相似之處。然而，當攜帶發夾結構的向導RNA與Cas組合后，Cas12及其變體能夠切割指定的DNA序列，其效率與和普通向導RNA組合時不相上下，但脫靶的情況要少得多。

此外，研究小組還發現，他們能夠通過微調發夾的結構來微調Cas剪刀的效能。一個“更緊湊”的發夾能夠使得鎖定更加牢固，這雖然會降低編輯效率，但也大大提高了準確性。一個“寬松的”發夾結構有助于保持Cas的活性，但對準確性卻沒有什么幫助。

“通過觀察R環的形成，我們能夠預測發夾向導RNA的能量情況。”論文作者解釋道。這種可預測性非常有價值——它能讓未來的科學家更簡易地校正發夾向導RNA和CRISPR系統的強度與準確性。

指南改變

這并不是科學家們第一次嘗試提高CRISPR的準確性。

之前的一個想法是使CRISPR系統變成“鐵三角”：一個向導RNA加兩個Cas剪刀。要進行DNA切割，兩個Cas必須都與相同的DNA序列相結合。雖然這是一個很巧妙的方法，但這個想法需要科學家們向細胞中輸入更多的成分，從而給本已很敏感的生態系統增加更多的不確定性。

另一個想法就是瓦解Cas剪刀，使他們不太可能亂剪，當然這個想法也有其軟肋。設計特定性質的蛋白質是極其困難和耗時的，科學家必須根據他們的需要定制每個Cas變體。

格斯巴赫解釋說：“每次我們發現一種新的CRISPR蛋白，都要進行大規模的重新改造，使其更加精確，因此這并不是一個簡易的解決方案。”

相比之下，杜克大學研究小組對向導RNA的探索，可能會從根本上改變今后CRISPR系統的設計。

“所有CRISPR系統都有向導RNA，這些短RNA更容易設計。” 寇卡科說道。

接下來，研究小組想進一步確認他們的發夾向導RNA替代品可以與其他已經在使用的Cas剪刀協同工作。他們還想要深入研究這種合作關系是如何運作的，并探索進一步提高靶向準確性的方法——不僅是在自由漂浮的細胞中，更重要的是，在患有遺傳疾病的動物模型中。