SWI評估2型糖尿病模型兔海馬組織β淀粉樣蛋白異常沉積

王夢辰，劉鐵利，蔣玉涵，韓 亮，王微微，苗延巍

(大連醫科大學附屬第一醫院放射科，遼寧 大連 116011)

糖尿病腦病是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的中樞神經系統并發癥。T2DM是認知功能下降的危險因素之一[1]，患者可表現與阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)類似的認知功能下降及癡呆癥狀[2]。AD患者腦組織典型病理改變為淀粉樣β蛋白(β-amyloid protein, Aβ)斑塊和tau蛋白過度磷酸化，伴有異常鐵沉積[3]。研究[4]發現T2DM腦病患者腦內具有與AD患者類似的高水平Aβ。目前主要采用PET-CT行腦內Aβ定量檢測[5]，價格昂貴，且存在輻射。SWI利用不同組織間磁敏感性的差異成像，可敏感顯示小靜脈、微出血、鐵沉積，且安全無輻射。T2DM認知障礙患者中，海馬為最常受累部位[6]，而右側海馬在空間記憶方面占優勢[7]。本研究觀察T2DM模型兔右側海馬區SWI相位值與海馬組織Aβ1-42表達的相關性，探討SWI檢測腦內異常Aβ蓄積的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 日本雄性大耳白兔15只，由大連醫科大學實驗動物中心提供，SPF級，8周齡，體質量2.66～3.44 kg，平均(3.02±0.27)kg，許可證編號：SCXK(遼)2013-0003。

1.2 動物分組與建模 將15只兔隨機分為T2DM組(10只)和對照組(5只)。T2DM組參照文獻[8]方法制備T2DM模型，具體方法：高脂高糖(基礎飼料53%、豬油10%、蔗糖37%)喂養8周，行口服糖耐量試驗及胰島素釋放試驗，對出現胰島素抵抗者至少停飼12 h；以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質量)麻醉后，經耳緣靜脈注射新配制的2%鏈脲佐菌素溶液(65 mg/kg體質量)，72 h后再次注射同等劑量新配制的鏈脲佐菌素溶液。之后每2周檢測1次空腹血糖，連續2次空腹血糖高于11.0 mmol/L視為造模成功，最終造模成功7只。對照組全程給予普通飼料喂養。

1.2 儀器與方法 于造模成功后第2、6、10周末行MR掃描。采用GE Signa HDxt 3.0T MR掃描儀，8通道膝關節線圈。掃描前給予兔3%戊巴比妥鈉溶液(1 ml/kg體質量)麻醉，掃描時俯臥位保定動物，使頭部稍抬高，暴露頸部，進行軸位T2 FLAIR及軸位SWI掃描，掃描層面垂直于顱底，覆蓋全腦，總掃描時間約10 min。參數：軸位T2 FLAIR序列，TR 9 000 ms，TE 168 ms，TI 2 250 ms，層厚3 mm，層間距0.5 mm，矩陣256×160，FOV 120 mm×120 mm，NEX 1，FA 90°；軸位SWI序列，TR 79.1 ms，層厚2 mm，層間距0 mm，矩陣320×288，FOV 120 mm×120 mm，NEX 0.69，FA 20°。

1.3 圖像后處理與分析 將3次掃描的SWI原始數據傳至GE Advantage Workstation 4.6后處理工作站，選擇Functool軟件進行去噪及濾波，獲得SWI幅度圖(magnitude imaging, MI)和相位圖(phase imaging, PI)，見圖1。對照兔腦解剖圖譜[9]，在SWI原始圖像右側海馬部位手動勾畫ROI(盡量避開腦脊液、血管、顱骨)，面積約4 mm2，獲得右側海馬區相位值， 以3次測量的平均值作為結果。

1.4 Aβ1-42表達檢測 完成MR檢查后，經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg體質量)深度麻醉動物，開胸后將導管插入左心室，經導管灌注常溫生理鹽水，待右心房流出液變清，灌入4%多聚甲醛約1 000 ml。斷頭后取腦，參照兔腦解剖圖譜[9]取右側海馬，將海馬組織常規固定、脫水、石蠟包埋、切片，行Aβ1-42免疫組織化學染色。采用高倍顯微鏡(×400)觀察海馬組織Aβ1-42表達，以Image-Pro Plus圖像分析軟件計算平均光密度。平均光密度=積分光密度/觀察區域面積。每只兔選取3張右側海馬切片染色，取平均值作為結果。

1.5 統計學分析 采用SPSS 20.0統計分析軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示。采用獨立樣本t檢驗比較同一掃描時間點2組間右側海馬相位值及海馬組織Aβ1-42表達的差異。采用重復測量方差分析比較同組3次右側海馬相位值的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Pearson相關分析觀察T2DM兔右側海馬區相位值與海馬組織Aβ1-42表達的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

T2DM組兔第2、6、10周末右側海馬區相位值逐漸減低(F=12.30，P<0.01)；對照組兔亦逐漸減低，但差異無統計學意義(F=3.05，P=0.85)。T2DM組第2、6、10周末右側海馬區相位值均低于對照組，但僅第10周末組間差異有統計學意義(t=-4.07，P<0.01)。見表1。

表1 T2DM組與對照組兔右側海馬相位值比較(×10-3，±s)

表1 T2DM組與對照組兔右側海馬相位值比較(×10-3，±s)

組別第2周末第6周末第10周末F值P值T2DM組(n=7)-(38.03±9.87)-(43.23±7.85)-(61.73±10.23)12.30<0.01對照組(n=5)-(29.22±7.22)-(33.50±8.25)-(41.00±7.42)3.050.85t值-1.79-2.06-4.07——P值0.110.07<0.01——

圖1 T2DM組和對照組兔腦SWI圖像及PI A、B.對照組兔造模第10周末SWI原始圖像(俯臥位，A)及PI(俯臥位，B)； C、D.T2DM組兔造模第10周末SWI原始圖像(俯臥位，C)及PI(俯臥位，D)

圖2 T2DM組和對照組兔右側海馬組織Aβ1-42免疫組織化學染色(×400) A. 對照組； B.T2DM組

T2DM組、對照組兔右側海馬組織Aβ1-42平均光密度值分別為0.20±0.04、0.09±0.01，組間差異有統計學意義(t=-7.07，P<0.01)，見圖2。

T2DM兔右側海馬區相位值與海馬組織Aβ1-42表達呈負相關(r=-0.88，P<0.01)，見圖3。

3 討論

糖尿病腦病發病機制尚不明確，可能與腦胰島素抵抗密切相關。正常狀態下，胰島素具有神經營養作用[10]。胰島素降解酶(insulin degrading enzyme, IDE)的主要功能是降解胰島素及Aβ，是調控胰島素和Aβ含量的關鍵物質。機體出現胰島素抵抗時，腦內胰島素含量增高，胰島素競爭性抑制IDE介導的Aβ降解，導致腦內Aβ清除障礙而蓄積[11]。除促進Aβ蓄積外，胰島素抵抗還可通過改變胰島素信號轉導、β分泌酶活性促進Aβ生成與蓄積[12]。糖尿病腦病的病理改變與AD腦改變極其相似[4]。Aβ是一種多肽類物質，最常見亞型是Aβ1-40和Aβ1-42，Aβ1-42的毒性更強，且更易蓄積，從而形成Aβ沉淀核心，引發神經毒性[13]。本研究結果顯示，T2DM組兔右側海馬區存在Aβ異常蓄積，與既往研究[4-5]結果相符。

鐵是影響腦組織相位值的主要物質，SWI相位信號與鐵含量呈負相關。Aβ蓄積時存在鐵結合位點[14]，Aβ斑塊形態與鐵直接相關，且可形成鐵-淀粉樣復合物[15]。鐵通過影響淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)mRNA表達調節APP，促進Aβ生成[16]。上述研究結果提示腦鐵含量與Aβ生成與蓄積相關，因此，理論上SWI可間接檢測腦內異常Aβ蓄積。Meadowcroft等[17]采用小鼠模型研究SWI相位值與腦鐵之間的關系，發現 Aβ可通過縮短橫向弛豫時間進而影響SWI相位值。本研究對T2DM組及對照組兔分別在造模后2、6、10周末行3次SWI掃描，結果顯示2組兔右側海馬區相位值隨造模時間延長而減低，且T2DM組均低于對照組。由此推測，隨兔齡增加及T2DM患病時間延長，2組兔腦內鐵含量均增多，而糖尿病加劇了兔齡增加所致的腦內鐵含量增多。

圖3 T2DM兔右側海馬區SWI相位值與海馬組織Aβ1-42表達相關性散點圖

本研究中T2DM組兔右側海馬區相位值與海馬組織Aβ1-42表達呈負相關，提示相位值可間接反映Aβ異常蓄積，這對進一步探討T2DM腦損傷SWI表現的機制具有重要意義。文獻[18]報道，通過SWI檢測淀粉樣斑塊內及周圍鐵沉積，可間接反映斑塊數量。關于AD小鼠的研究[19]結果也顯示SWI平均相位值與鐵蛋白數量、斑塊范圍具有相關性，提示相位值可反映Aβ蓄積。Yang等[20-21]報道，SWI檢測結果顯示T2DM患者腦組織磁敏感值與其認知評分相關，而認知評分與Aβ表達呈負相關。本研究結果顯示T2DM兔右側海馬相位值與Aβ1-42蓄積并非完全相關(完全相關指r=1或-1)，提示除Aβ周圍鐵沉積之外，可能尚有其他因素導致相位值變化，如微出血[22]。

綜上所述，SWI可間接反映T2DM兔海馬組織Aβ蓄積。但本研究樣本量較少，觀察腦區僅局限于右側海馬，且未行鐵蛋白染色，有待進一步完善。