CYP2C19基因多態性與PCI術后氯吡格雷治療患者血小板功能、炎性指標及病情轉歸的相關性

吳錚，李文錚，王長華，程姝娟， 柳景華

經皮冠狀動脈介入(PCI)是治療冠心病的有效手段，能夠改善患者的臨床癥狀，但部分患者于PCI術后血小板仍可聚集出現再栓塞，進而影響病情的遠期轉歸。氯吡格雷聯合阿司匹林是PCI術后常規的抗血小板治療方式，能夠抑制血小板聚集、降低血栓形成的風險[1]。盡管如此，仍有部分患者在PCI術后接受抗血小板藥物治療后繼續出現血小板聚集，嚴重者形成支架內血栓。近年來關于抗血小板藥物的研究認為，氯吡格雷進入體內后不直接發揮抗血小板作用，而是需要通過CYP2C19基因編碼的細胞色素P450將該藥物代謝為有抗血小板活性的形式，進而發揮抑制血小板聚集的作用。在該過程中，CYP2C19基因的多態性直接影響了編碼產物的催化功能，進而導致氯吡格雷抗血小板效應發生改變[2-3]。為了明確CYP2C19基因多態性對氯吡格雷抗血小板治療效果的影響，本研究具體分析了CYP2C19基因多態性與PCI術后患者氯吡格雷治療血小板功能、炎性反應及病情轉歸的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1—4月首都醫科大學附屬北京安貞醫院心內科接受PCI及術后氯吡格雷、阿司匹林抗血小板治療的冠心病患者204例作為研究對象，根據CYP2C19基因多態性分為野生型患者93例、雜合突變型患者57例、純合突變型患者54例。3型患者一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經醫院倫理委員會審批通過，全部患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 納入標準：(1)符合不穩定型心絞痛診斷標準；(2)自愿接受PCI手術；(3)術后給予氯吡格雷300 mg和阿司匹林300 mg負荷劑量治療。排除標準：(1)既往有急性心肌梗死發作病史的患者；(2)PCI術前血小板計數異常的患者；(3)使用噻氯匹定、沙格雷酯等影響血小板功能的藥物；(4)存在應用阿司匹林、氯吡格雷禁忌證的患者。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 CYP2C19基因多態性評價： PCI術前采集患者空腹肘靜脈血3 ml，采用基因組DNA提取試劑盒分離血液樣本中的基因組DNA，設計CYP2C19基因*2(rs4244285)的引物(上游引物5'-CATCTTTGATTCTCTTGT-3'，下游引物5'-CCAATCATTTAGCTTCAC-3')及*3(rs4986893)的引物(上游引物5'-TGAATCACAAATACGCAA-3'，下游引物5'-ATATTCATTTCCTGTGCA-3')，對基因組DNA進行PCR擴增后取PCR產物，在1.5%瓊脂糖凝膠內進行電泳，根據電泳結果判斷CYP2C19基因多態性：CYP2C19*1/*1為野生型，CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3為雜合突變型，CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3為純合突變型。

1.3.2 血小板功能指標及炎性指標檢測：PCI手術前采集患者肘靜脈血5 ml備用，檢測以下指標。(1)血小板功能指標，采用流式細胞法測定CD62P、CD63、PAC-1的水平，采用血栓彈力圖儀測定血栓形成速度(A)、最大振幅(MA)、凝血反應時間(R)、血細胞凝集塊形成時間(K)。(2)炎性指標，采用上海西唐公司的酶聯免疫吸附法測定C反應蛋白(CRP)、CD40配體(CD40L)、可溶性細胞間黏附分子1(sICAM1)、白細胞介素-8(IL-8)的含量，貨號分別為F00451、F00410、F01050、F01340。

表1 3型患者一般資料比較 [例(%)]

1.3.3 血小板聚集率及氯吡格雷抵抗評估： PCI術后給予患者阿司匹林300 mg和氯吡格雷300 mg負荷24 h，采集患者肘靜脈血3 ml，離心提取富血小板血漿、再離心提取貧血小板血漿，用貧血小板血漿調整富血小板血漿的血小板濃度至 200×109/L，采用血小板功能分析儀測定血小板聚集率后計算血小板抑制率；氯吡格雷治療后血小板聚集率下降不足10%定義為氯吡格雷抵抗。

1.3.4 觀測、記錄嚴重心臟事件： PCI術后對患者進行為期1年的隨訪，嚴重心臟事件為隨訪終點，嚴重心臟事件的定義為心血管病死亡、急性心肌梗死、支架內血栓形成、預期外的支架植入術。

2 結 果

2.1 3型患者血小板功能指標比較 治療30 d后， CD62P、CD63、PAC-1、A、MA水平比較，純合突變型患者>雜合突變型>野生型患者，而R、K水平比較，純合突變型<雜合突變型<野生型患者(P<0.01)，見表2。

2.2 3型患者炎性指標比較 治療30 d后，CRP、CD40L、sICAM1、IL-8水平比較，純合突變型>雜合突變型>野生型患者(P<0.01)，見表3。

2.3 3型患者病情轉歸比較 阿司匹林300 mg和氯吡格雷300 mg負荷24 h后，血小板抑制率比較，純合突變型<雜合突變型<野生型患者，而氯吡格雷抵抗率、嚴重心臟事件發生率(治療1年內)比較，純合突變型>雜合突變型>野生型患者(P均<0.05)，見表4。

3 討 論

阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治療是PCI術后重要的輔助治療方式，通過抑制血小板聚集來預防支架內血栓形成、降低遠期心血管事件的發生風險。氯吡格雷的抗血小板活性通過阻礙血小板P2Y12受體下游信號通路的活化來發揮，該藥物本身是無活性的前體，在體內通過P450氧化酶系統代謝后產生具有抗血小板活性的產物[4]；當P450氧化酶系統的功能發生紊亂時，氯吡格雷的抗血小板活性會受到影響[5]。CYP2C19基因的編碼產物是P450氧化酶系統的重要組成部分，在氯吡格雷的代謝過程中起到關鍵作用[6]。近年來越來越多的研究發現，CYP2C19基因的*2等位基因及*3等位基因存在多態性，表現為等位基因的突變或缺失；*2等位基因的突變會影響轉錄蛋白的剪切活性，*3等位基因的突變會降低蛋白轉錄的活性[7-8]。CYP2C19*2和*3等位基因發生突變后，編碼產物活性的變化會直接影響氯吡格雷的抗血小板功能。

表2 3型患者血小板功能指標比較

表3 3型患者炎性指標比較

表4 3型患者病情轉歸比較

本研究在PCI術后使用阿司匹林300 mg和氯吡格雷300 mg負荷劑量進行抗血小板治療，通過分析血小板聚集率來評估血小板抑制率及氯吡格雷抵抗率，存在CYP2C19*2和*3等位基因突變患者的血小板抑制率低于未發生突變的野生型患者，氯吡格雷抵抗率則高于未發生突變的野生型患者，且發生純合突變患者血小板抑制率、氯吡格雷抵抗率的改變較雜合突變型更為明顯。這一結果提示CYP2C19*2和*3等位基因的突變會影響氯吡格雷的抗血小板活性，且純合突變的影響較雜合突變更為顯著，藥物的抗血小板活性受影響后會促進PCI術后發生血小板聚集，進而增加心血管事件的發生風險。本研究進一步對PCI術后1年內嚴重心臟事件的隨訪發現，CYP2C19 基因突變患者的嚴重心臟事件發生率高于野生型患者，且純合突變患者的嚴重心臟事件發生率高于雜合突變患者。這一隨訪結果與血小板抑制率的變化結果吻合，CYP2C19 基因突變后血小板抑制率降低并且遠期嚴重心臟事件的發生率增高。

在血小板發生活化和聚集的過程中，血小板表面和血小板內的多種信號分子發生激活[9-10]，而氯吡格雷通過拮抗血小板P2Y12受體下游信號通路能夠使相應信號分子的激活受阻。CD62P和PAC-1是血小板表面的特異性標志物，CD63是血小板內的信號轉導分子，在血小板的活化過程中起到關鍵作用[11-12]。本研究對上述血小板活化指標的分析發現，CYP2C19 基因突變患者的CD62P、CD63、PAC-1水平均明顯高于野生型患者，且純合突變患者的CD62P、CD63、PAC-1水平均明顯高于雜合突變患者。血小板在多種信號分子的作用下發生活化后，血栓形成能力增強，在血栓彈力圖中表現為R和K的縮短、A和MA的增大[13-14]。進一步通過分析血栓彈力圖參數來反映血小板功能，CYP2C19 基因突變患者的R和K水平均明顯低于野生型患者、A及MA水平明顯高于野生型患者，且純合突變患者的R和K水平均明顯低于雜合突變患者、A及MA水平明顯高于雜合突變患者。以上血小板活化指標和血栓彈力圖參數的結果表明，CYP2C19 基因突變后血小板的聚集功能增強且純合突變對血小板聚集功能的增強作用高于雜合突變。

血小板活化過程不僅涉及自身信號分子的激活，還與體內炎性反應激活過程中炎性因子的作用有關， 炎性因子能夠促進血小板聚集形成血栓、增強血小板的活化狀態[15]。CRP是肝細胞合成的炎性標志物，屬于急性時相蛋白，炎性反應過程中促炎因子能夠刺激肝細胞內CRP的合成，分泌進入血液循環的CRP能夠增強炎性反應的程度；CD40L是炎性細胞表面受體CD40的配體，兩者結合后能夠促進炎性細胞的遷移、浸潤并參與炎性反應的級聯激活[16]；sICAM1和IL-8分別是具有黏附活性和趨化活性的細胞因子，能夠促進炎性細胞的黏附、趨化運動，有利于炎性反應的級聯放大[17-18]。本研究對上述炎性反應指標的分析發現，CYP2C19 基因突變患者的CRP、CD40L、sICAM1、IL-8水平均明顯高于野生型患者，且純合突變患者的CRP、CD40L、sICAM1、IL-8水平均明顯高于雜合突變患者。這一結果表明CYP2C19 基因突變后炎性反應的激活程度加劇，且純合突變對炎性反應的激活作用強于雜合突變。

綜上所述，CYP2C19基因*2和*3等位基因突變能夠加重血小板抵抗、促進血小板聚集、激活炎性反應。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

吳錚、程姝娟：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；李文錚：分析試驗數據，論文審核;王長華、柳景華：臨床信息采集，資料搜集整理，進行統計學分析