草地螟觸角普通氣味結合蛋白基因的克隆及序列分析

鐘　濤　尹　姣　劉　懷　王進軍　李克斌　韋永貴　曹雅忠

摘要利用RT-PCR結合RACE技術克隆了編碼草地螟(Loxostege stzcticalis)觸角中一種普通氣味結合蛋白的基因。序列分析表明，成熟蛋白的序列中含有閱讀框序列，推導的氨基酸序列與已報道的11種鱗翅目昆蟲普通氣味結合蛋白I比較，平均相似度在62.3％左右，并擁有氣味結合蛋白的典型結構特征。該基因歸屬于普通氣味結合蛋白I基因亞族。因此將它命名為LstiGOBPl。

關鍵詞草地螟；觸角；普通氣味結合蛋白；RT-PCR；RACE

中圖分類號Q 785，S 433.4

草地螟[Loxostege sticticalis(Linnaeus)]又名網錐額野螟、甜菜網螟，屬鱗翅目、螟蛾科、野螟亞科、錐額野螟屬，是我國東北、華北和西北地區發生的多食性害蟲之一，取食為害大豆、苜蓿和甜菜等作物，具有遠距離遷飛為害和周期性暴發特性，嚴重威脅了我國北方的農牧業生產。

草地螟對寄主植物具有明顯的選擇取食、產卵為害的特性，其中，嗅覺識別又是蛾類感知寄主植物信息的重要方式。靈敏的嗅覺在草地螟搜尋合適的寄主植物及選擇產卵地的過程中發揮著重要作用，而觸角作為昆蟲最主要的嗅覺感受器官，能夠依靠化學物質進行信息的傳遞，從而在數萬種化合物分子中識別出它所需要的氣味分子。已有研究證實，在鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和膜翅目等全變態昆蟲中都發現了氣味結合蛋白(OBPs)的存在，這種蛋白能結合疏水性氣味化合物，并攜帶它們快捷地穿過水溶性的淋巴液，實現氣味在觸角表皮與嗅覺神經元上的膜結合受體之間傳遞。

目前，對草地螟與寄主植物之間的化學通訊研究比較缺乏，僅在草地螟對寄主植物的選擇性及寄主植物的揮發物質行為反應等方面進行了研究。因此，開展草地螟感知、識別寄主的分子機理方面的研究不僅能夠揭示其選擇寄主植物的分子機制，而且還可以為進一步了解草地螟與寄主植物之間的化學信息聯系，闡明草地螟選擇寄主產卵與取食的內因提供可靠的理論依據，同時為研制、開發防控草地螟的藥劑提供新思路。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1供試昆蟲

草地螟幼蟲用野生灰菜飼養，成蟲羽化后3 d內分別剪下雌、雄觸角，立即放在液氮中速凍，然后-70℃保存。

1．1．2菌種及質粒

pGEM-T Easy載體購自Promega公司，感受態大腸桿菌DH5a購自北京博大泰克公司。

1．1．3主要試劑及工具酶

Ex Taq DNA聚合酶，限制性內切酶EcoR I、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、3'-Full RACE CoreSet購自TaKaRa公司，Ampicillin、X-gal、IPTG購自北京博大泰克公司，總RNA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒等購自QIAGEN公司，質粒小量快速抽提試劑盒及DNA Marker(DL4000和D50)購自北京明日百傲公司，其他試劑均為國產或進口分析純試劑。

1．2方法

1．2．1觸角總RNA的提取及cDNA第1鏈合成

將保存的草地螟雌、雄成蟲觸角各取20 mg，加液氮搗碎組織后，使用QIAGEN公司的RNeasyMini Kit提取總RNA，經NanoDrop核酸濃度儀測定含量后，使用cDNA第1鏈合成試劑盒合成CD—NA第1鏈。

1．2．2引物設計

根據GenBank中已登錄的其他蛾類昆蟲的GOBPl基因序列[家蠶(Bombyx mori)、黃地老虎(Agrotis segetum)、小地老虎(A.ipsilon)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、煙芽夜蛾(Heliothis vi—rescens)、斜紋夜蛾(Spodoptera litura)、中國柞蠶(Antheraea pernyi)、煙草天蛾(Manduca sexta)、煙實夜蛾(Helicoverpa assulta)的GenBank登錄號分別為NM_001044031、DQ838577、DQ838578、AY049739、 X96862、EFl59978，Y10970、M73797、AY864774]設計并合成引物：正向引物(gps4)：5-GTBATGAARGAYGTCACBCTNGG-3；反向引物(gpa4)：5-AGGTTRAAGTGBCKGCTCAT-3(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。

1．2．3PCR擴增

以合成的cDNA第1鏈為模板，反應體系為cD-NA 2μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP2taL(各2.5 mmol/L)，TaKaRa Ex Taq(5U/μL)0.25μL，正反引物各1μL(10 μmoL/L)，加滅菌水至25μL，混勻、離心，然后放入PCR儀(Eppendorf Mastercycler Gra—dient)擴增。反應條件為94℃變性3 min；接著35個循環，循環條件為94℃45 s，56.6℃45 s，72℃1 min，最后72℃延伸5 min。擴增完畢后，用2％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化，并回收目的片段。

1．2．4PCR產物的克隆和鑒定

利用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒回收PCR產物，將純化得到的DNA連接到pGEM—T Easy載體，再轉化到感受態大腸桿菌DH5a中，然后涂布在含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃培養16 h。待長出藍、白斑后，隨機挑取白斑，培養后采用質粒小量快速抽提試劑盒提取質粒，利用菌落PCR和EcoR工酶切的方法，鑒定重組克隆PGEM/LstiGOBPl。

1．2．5序列測定和分析

DNA的序列測定在北京奧萊博生物科技有限責任公司進行。

1．2．6RACE擴增

以RT-PCR得到的目的DNA序列，按照試劑盒的要求設計引物，并參照說明書擴增該基因的cDNA的3末端序列。目的DNA片段的上游特異性引物(3R-g01)：5-GACGGAGGAGTTCTTC—CACTTCTG-3(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)；試劑盒中的下游接頭引物(3sites Adap—tor Primer)：5-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3。

1．2．7RACE產物的克隆和鑒定

方法參照1．2．4 PCR產物的克隆和鑒定。

1．2．8序列測定和分析

DNA的序列測定在北京奧萊博生物科技有限責任公司進行。

2結果與分析

2．1GOBP1基因的擴增和克隆

以草地螟觸角cDNA為模板擴增的DNA產物，分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析

。從中可以明顯看出，PCR及3RACE擴增的產物長度分別達到170 bp和500 bp左右，并且它們分別經EcoR I酶切后得到的條帶與設計相符。

2．2序列測定和分析

草地螟CK)BPl基因的核苷酸序列，推導的氨基酸序列位于核苷酸序列之下，方框內為保守的半胱氨酸位點。該基因已在GenBank中登錄，登錄號為EU413989。

序列測定和結果分析表明，已獲得草地螟(X)BPl基因開放閱讀框為423 bp，編碼142個氨基酸殘基，預測的分子量為16.1ku，等電點為5.00。該蛋白擁有氣味結合蛋白的共同特征，序列中含有6個保守的半胱氨酸位點，呈酸性，且雌雄蟲GOBPl的核苷酸序列相同。

利用DNASIS軟件，根據Robson的方法對編碼GOBPl-Lsti的mRNA進行了二級結構預測，結果表明該基因的二級結構主要為a一螺旋。此外，采用Kyte和Doolittle等的方法對GOBPl-Lsti氨基酸序列進行親脂性分析，表明該蛋白中包含3個親脂性區域。這些區域很可能是親脂性氣味物質的結合位點。

利用NCBI BLAST network server在Gen—Bank/EMBL中進同源性搜索發現，在GenBank/EMBL中登錄的有完整序列的昆蟲GOBPl基因共11種。基于序列的同源性比較發現(表1)，昆蟲GOBPl氨基酸序列具有明顯的同源性，平均相似度在62.3％左右。

通常物種間的親緣越近，GOBPl的核苷酸和氨基酸序列的同源性也會越高。從LstiGOBPl與其他11種已知蛾類的進化樹可以看出，草地螟與它們在進化水平上相隔很遠。因此，相對其他11種蛾類來說，草地螟與它們的親緣較遠。

3討論

本試驗利用RT-PCR結合RACE技術從草地螟觸角RNA中克隆了編碼草地螟GOBPl的基因，根據測序結果推導的氨基酸序列具有氣味結合蛋白的典型特征，屬于GOBPl蛋白亞族，并依據慣例將它命名為LstiGOBP1。

鱗翅目昆蟲觸角中的普通氣味結合蛋白(GOB—Ps)的基因序列高度同源，氨基酸和核苷酸序列都非常保守。在LstiGOBPl蛋白序列中包含7個半胱氨酸位點，其中6個半胱氨酸的空間分布在不同的物種間始終恒定(圖6)。半胱氨酸普遍遵循著這樣一個規則，X₁₈-Cys-X₃₀-Cys-X₃-Cys-X₄₂-Cys-X_8-10-Cys-X₈-Cys-X_24-26，其中X代表任意氨基酸。而這6個保守的半胱氨酸在LstiGOBPl的空間分布恰好符合X₁₅-Cys-X₃₀-Cys-X₃-Cys-X₄₂-Cys-X₁₀-Cys-X₈-Cys-X₂₇，很顯然，LstiGOBP1的N末端還不十分完整。

在對草地螟普通氣味結合蛋白家族的兩個成員(GOBPl和GOBP2)的分析中(另文發表)，發現GOBPl基因并沒有GOBP2基因那樣在分科水平上高度保守，而是呈現出離散的特點，例如97—100、117—122氨基酸之間具有明顯的差異，這可能反映了LstiGOBPl在進化中的變異與功能的分化。Krieger提出氣味結合蛋白的種類在昆蟲觸角中是極其龐大的觀點，而Vogt也認為OBPs的種類和變異恰好反映了昆蟲間化感行為的多樣性。

可以通過二硫鍵的聯結信息來了解翻譯后的蛋白修飾情況。經SCRATCH預測LstiGOBPl的蛋白序列，二硫鍵的發生位點分別在Cysl6-Cys51、Cys105-Cys119和Cys94-Cys114。而Leal在對家蠶信息素結合蛋白基因的二硫鍵結構的研究中發現，該蛋白中存在3個二硫鍵，分別位于Cys19-Cys54、Cys50-Cys108和Cys97-Cys117。考慮到LstiGOBP1蛋白序列還不完整，所以與Leal的研究結果是一致的。但僅僅在第2個二硫鍵的構成上有所不同，在LstiGOBP1蛋白序列中，由第5(Cys105)與第7(Cys119)共同形成了二硫鍵。這種差異很可能決定了GOBP1結合氣味因子的形狀和種類。此外，在多數已研究的蛾類中，都存在著第7個半胱氨酸，而且它的位點也是十分保守的(圖6)。

GOBPs的三維結構目前還不十分清楚，但是其疏水和親水結構域在載體蛋白中的特性分布非常重要，Krieger預測的疏水結構域通常在第40～60個氨基酸之間，這可能是用來結合氣味化合物的區域。Steinbrecht的研究小組證實GOBPs在觸角中是專一表達的，分布在含有特殊識別功能的受體細胞的感覺器中，它們只對食物和寄主氣味有特殊反應，但不包括信息素分子。Feng也證實GOBPl具有更廣泛地結合綠色植物和有花植物的氣味分子的功能。LstiGOBP1同樣包含了交替變化的疏水和親水結構域，這種結構決定了其結合氣味分子并運送的功能。

通常GOBP1成熟蛋白包含144～146個氨基酸，而氨基酸數目的恒定也維持GOBP1蛋白的功能穩定。N末端親水性區域通常有18～26個氨基酸，該肽段揭示了信號肽的性能特征信息。目前，在LstiGOBP1序列中還未包含完整的N末端信息，5RACE試驗正在開展之中。