菲利普孢囊線蟲侵染后小麥防衛相關UniGene表達特性

邢小萍，周榮華，張盼盼，袁虹霞，李洪連

(河南農業大學植物保護學院,河南鄭州 450002)

菲利普孢囊線蟲(Heteroderafilipjevi)系危害小麥的重要孢囊線蟲種類，目前在全世界10多個國家發生危害[1-4]，在我國，該線蟲在黃淮麥區發生危害嚴重[5-6]。

病原物與寄主植物互作的過程中，植物體內的水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和乙烯(ethylene，ETH)介導的抗病基礎傳導通路(basal signaling pathways,BSPs)產生的信號分子可激活一些防御基因的表達，可能會啟動SA、JA和ET信號通路，植物出現對生物脅迫的廣譜抗性[7-9]。前人報道，煙草[10]、馬鈴薯[11]、擬南芥[12-13]等受到病原物侵染后，SA、JA和ETH作為內源信號分子能夠激活植物體內的系統抗性或抗病相關蛋白的表達[14]。在植物受病原物侵染后，已克隆的參與防御系統激活的基因主要有鈍化病原物致病因子的酶類、參與細胞壁修飾功能的一些蛋白、抗菌活性物質、病程相關蛋白(pathogenesis-related protein,PRP)等[15]。植物病原物侵染寄主后誘導表達產物往往通過改變細胞代謝激發和調控防衛反應基因，或激活信號傳導通路的基因[16]。Tak和Mhatre[17]從受到外界因素刺激后抗性增強的葡萄體內克隆得到bZIP轉錄因子基因VvbZIP23。在小麥體內也克隆得到與應激和防御有關的TabZIP基因[18-19]。研究證實，WRKY轉錄因子在植物受到外界刺激后被誘導表達，主要參與植物的抗逆反應[20-21]和防御反應[22-24]。MYB轉錄因子在植物受到外界生物或非生物刺激后被誘導表達，調控植物防衛反應[25-26]。小麥受病原菌侵染后誘導表達的與信號傳導有關的TaPIM1基因參與植物的防御反應，該基因的表達可使植物抗性明顯增加[27]。

綜上所述，病原物誘導條件下，對植物防衛相關基因的表達及功能研究是植物抗病分子生物學的重要研究方向之一。鑒于此，本研究利用real time-PCR技術，對前期研究中篩選的與細胞結構、防衛反應、轉錄因子及信號傳導有關的10個基因在抗、感小麥品種的幼苗接種菲利普孢囊線蟲(H.filipjevi)后不同時段的相對表達量進行分析，旨在揭示該類基因在小麥受到H.filipjevi侵染后的合胞體建立階段的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種：感病品種溫麥19，由河南省農科院秋樂種業有限公司提供；抗病種質資源抗線2號，由中國科學院成都生物所提供。

供試線蟲群體：H.filipjevi許昌群體[5]，采自河南省許昌縣河街鄉半坡鋪村小麥病田。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥根組織的準備

供試小麥材料的種子經表面消毒后，在20±2 ℃的培養箱內催芽后播至裝滿滅菌沙土的營養缽(直徑10 cm×高10 cm)中，在光/暗比14/10 h、晝/夜溫度23±2 ℃/15±2 ℃的人工氣候箱內培養1周，小心拔出幼苗，將根系的沙土輕緩地沖洗干凈后放置在鋪有滅菌濕濾紙的淺塑料盤(長40 cm,寬20 cm,深5 cm)中，每株小麥幼苗的根系均勻滴加0.5 mL從病田采集的孢囊孵出的二齡幼蟲(J2s)配成2 000條·mL-1的懸浮液，對照組根系滴加0.5 mL的無菌水。之后在小麥根系上覆蓋兩層浸濕的無菌濾紙，淺塑料盤放置于育苗條件下的人工氣候箱中培養。分別在接種后1、2、3、5、7和9 d采集幼苗根系組織，每個材料各時間點處理組和對照組分別采集4株，經液氮快速冷凍后置于-80 ℃保存備用。

1.2.2 總RNA提取、檢測、純化及反轉錄

小麥根系總RNA 參照Trizol (invitrogen)提取液操作手冊提取。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析所提取RNA 樣品的28S和18S條帶，檢測其完整性。參照RQ1RNase-FreeDnase (Promega,USA)試劑盒說明書去DNA。隨后，按照cDNA 合成試劑盒操作說明書以隨機引物Oligo dT進行反轉錄成合cDNA，-80 ℃保存。

1.2.3 Real time PCR 分析

引物信息：利用Primer Premier 6.0設計各基因的引物 (表 1)，小麥的肌動蛋白基因(actin) 做為內參基因，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

表1 基因的Real time PCR引物信息Table 1 Primer of genes for real time PCR

Real time PCR定量檢測體系及結果分析：使用SYBR Premix (SYBR Green) 試劑盒進行real time PCR檢測。反應體系為12 μL，包含SYBR Premix 6 μL，正反向引物 (10 μmol·L-1) 各0.48 μL，cDNA 模板1.2 μL， 50×ROX Reference Dye 0.26 μL，RNase-Free ddH2O 3.6 μL。反應程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環。每個樣品3個重復。根據擴增曲線得到每個基因的Ct值，采用2-△△Ct法分析檢測基因的相對表達量[28]。采用 SPSS 20.0 統計軟件對數據進行平均數及標準誤分析。

2 結果與分析

2.1 RNA質量及PCR體系檢測

提取的總RNA經紫外分光光度計檢測，OD260/280均在1.8～2.1之間，隨機挑取6個樣本用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，28 S和 18 S條帶清晰，表明所提RNA無明顯降解(圖1)。采用常規PCR對所設計的引物進行擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，擴增獲得與目的條帶大小相符的特異性基因片段，表明引物的特異性較好(圖2)。real time PCR分析結果顯示，各檢測基因擴增后融解曲線均為單峰。

圖1 所提取總RNA 的質量檢測Fig.1 Quality detection of total RNA

1:DNA marker; 2:UniGene JV948284; 3:UniGeneAK335102; 4:UniGene AK330737; 5:UniGene CV767657; 6:UniGene JP233598; 7:UniGene JP852719; 8:UniGene JF951950; 9:UniGene CD877975; 10:UniGene DR737925; 11:UniGene EU665453; 12:Actin

圖2 常規PCR 的擴增產物

Fig.2 Products amplified by conventional PCR

2.2 細胞結構相關基因的表達

接種菲利普孢囊線蟲后，與細胞結構相關的UniGene AK335102和UniGene DR737925在抗病材料抗線2號和感病品種溫麥19中不同時段的表達如圖3。UniGene AK335102在溫麥19中隨時間延續其表達量增加；而在抗線2號中，在接種后1 d時，其表達量為1.079，在接種后的2、3和9 d，其表達量低于接種后1 d，而在5 和7 d其表達量遠高于其他時段，以7 d 時表達量最高，接種后1、3、5和7 d，其表達量是溫麥19中的 2.997、1.041、3.175和5.668倍，說明UniGene AK335102在抗線2號中表達量高于溫麥19。UniGene DR737925在接種后的1和3 d時，在溫麥19中的表達量低于其在2、5、7和9 d的表達量；在抗線2號中，接種后該基因的表達量均較低，只在9 d后，其表達量較高；UniGene DR737925在溫麥19中各時間點的表達量均比抗線2號中高，尤其是在接種后的2、5和7 d，表達量是抗線2號中的15.353、12.442和 20.079倍。

2.3 應激與抗性相關基因的表達

在接種菲利普孢囊線蟲2 d時，UniGene JV948284在溫麥19中的表達量明顯高于其他時段；而在抗線2號中的表達量在接種后5和7 d時明顯高于其他時段。UniGene JV948284在溫麥19中相對表達量較高，在接種菲利普孢囊線蟲的1、2、3、5、7、9 d，在溫麥19中的相對表達量分別是抗線2號中的7.553、44.071、17.655、 5.291、7.552和1.887倍 (圖3)。

UniGene JP233598在接種后 2 d時，在溫麥19中的表達量較高，隨接種時間的延續，表達量逐漸減少；在抗線2號中，接種后5和7 d時表達量明顯高于其他各時段，在接種的后期，表達量高于接種初始階段。在接種后1～3 d，該基因在兩種材料中的表達量差異相對較小，接種后的3、5、7和9 d，在抗線2號中的表達量分別是溫麥19中的1.128、6.451、12.952和6.878倍。

在溫麥19中，UniGene JP852719在接種后1和5 d時的表達量較低，其他各時段的相對表達量居于0.108～0.160之間；在接種后7 d時，在抗線2號中的表達量高于其他各時段；在接種5和9 d時的表達量高于接種后的1、2和3 d。在接種后2、3 d時，UniGene JP852719在溫麥19中的表達量高于抗線2號，但在接種5和7 d時，在抗線2號中的表達量明顯高于溫麥19；在接種后9 d時，在兩種材料中的表達量基本持平。

UniGene CV767657在溫麥19中的表達量在接種后期低于早期；抗線2號中該基因在接種后的3和9 d時表達量明顯高于其他各時段。接種線蟲后的1、2和5 d，UniGene CV767657在溫麥19中的表達量明顯高于抗線2號，分別為 67.143、29.530和9.337倍，而接種后3和9 d時，在抗線2號中的表達量明顯高于溫麥19，分別為 3.969和51.762倍。

2.4 轉錄因子和信號轉導基因的表達

UniGene EU665453屬于WRKY轉錄因子，在接種菲利普孢囊線蟲后的前3 d，該基因在溫麥19中的表達量變化不明顯，在接種后3 d，其表達量略有降低，在接種后5 d時，其表達量增加近1倍，在7 d和9 d時，該基因的表達量相較于接種早期明顯增加。在抗線2號中，UniGene EU665453在接種后3 d時表達量較高，為接種后1 d時的15.962倍，在接種后5 d時，其表達量比3 d時低2.733倍，之后其表達量呈增加趨勢(圖3)。

UniGene JF951950和UniGene AK330737屬于MYB族轉錄因子。在溫麥19中，接種后 2 d時，UniGene JF951950表達量比其他各時間點略高；在抗線2號中，該基因僅在接種后5和 7 d表達量較高，在接種后1 d，該基因在溫麥19和抗線2號中的表達量差異不大，在接種后2、3和9 d時，溫麥19中的表達量是抗線2號中的 2.870、3.096和1.686倍。在接種后5和9 d時，UniGene AK330737在溫麥19中的表達量比其他各時間點高；在接種3、5、7和9 d時，其在抗線2號中的表達量明顯高于接種后的1和2 d；接種后3、5和7 d時，其在抗線2號中的表達量明顯高于溫麥19，分別為11.614、1.799和 10.498倍。

與信號轉導相關的UniGene CD877975在接種菲利普孢囊線蟲后，在溫麥19中的表達量隨接種時間的延續逐漸增加，在9 d時，其表達量為26.183；而在抗線2號中，該基因的表達量隨接種時間的延續逐漸降低，在1 d時，抗線2號中的表達量為48.924，為溫麥19中表達量的 55.532倍，而其表達量為1.645在接種后9 d 時，在溫麥19中的表達量比抗線2號中的高15.917倍 (圖3)。

3 討 論

3.1 與細胞結構相關基因

果膠裂解酶和富含羥脯胺酸糖蛋白影響高等植物的細胞結構，果膠裂解酶，能降解植物細胞壁，軟化植物組織，現已在番木瓜等多種植物中分離得到[29]，富含羥脯氨酸糖蛋白廣泛存在于高等植物細胞壁中，當植物受到病原物侵染等外界刺激時，細胞壁中該類蛋白含量增加，可能與細胞壁強固和植物受到外界刺激后早期的防御、抗性密切相關[30]。本課題組運用基因芯片技術分析了對菲利普孢囊線蟲感病的小麥品種根系受到線蟲侵染后早期的基因表達特征，發現與果膠裂解酶相關的UniGene AK335102表達受到抑制。本研究發現，在抗性材料抗線2號接種菲利普孢囊線蟲后的1、5和7 d，該基因的相對表達量明顯比感病品種溫麥19高，推測該基因可能在線蟲侵染后取食位點建立和合胞體發育過程中發揮作用。UniGene DR737925影響細胞壁中富含羥脯氨酸糖蛋白的含量，本研究中，接種菲利普孢囊線蟲后的各時段，UniGene DR737925在感病品種溫麥19中的表達量遠高于抗性材料抗線2號，該基因可能在線蟲侵染的過程中，發揮固化細胞壁的 作用。

3.2 應激與抗性相關基因

富脯氨酸蛋白是植物的一個細胞壁蛋白，在植物受到生物或非生物刺激后誘導表達[31]，該基因可能在植物細胞發育及抗逆過程中發揮作用。Gothandam等[32]研究發現，水稻中新發現的一個在花中特異表達的富脯氨酸蛋白OsPRP3 在過表達時，植株的耐冷性顯著增強，從而提高耐寒性。另外，當植物受傷后，傷口所在組織內富含脯氨酸蛋白[33-34]。本研究中，與線蟲侵染應激反應相關的UniGene JV948284在接種菲利普孢囊線蟲的不同時段，溫麥19 中的表達量明顯高于抗線2號，這可能與易感材料對線蟲侵染的積極響應有關。外界因素誘導后，植物體內一些與抗性相關的基因被誘導表達。Yu等[35]研究發現，抗性小麥品種在接種條銹病菌后，過敏性誘導基因Ta-hir1表達量明顯增高。轉錄因子往往在植物受到外界刺激后誘導表達，該類基因中有些基因已被證實與植物的各類抗性密切相關，如葡萄在受到逆境脅迫后，bZIP轉錄家族的基因VvbZIP23強烈表達，抗逆性明顯增強[17]；Zhang等[18]和張 毅等[19]研究發現，小麥在受到條銹病菌侵染后誘導表達的TabZIP基因與抗病和抗逆(低溫、高鹽)有關；小麥中存在多個WRKY轉錄因子與小麥抗逆反應[20-21]和防衛反應[22-24,36]有關。本研究中，UniGene EU665453在接種菲利普孢囊線蟲后的早期，在溫麥19 中的表達量變化不明顯，而在抗線 2 號中，在接種后 3 d時相對表達量較高。在接種菲利普孢囊線蟲的后期，在抗、感小麥中的表達量均逐漸增加，但在溫麥19中變化更劇烈，推斷該基因可能與合胞體維持有關。孢囊線蟲侵染后8 d左右時合胞體形成，之后抗病小麥根系的合胞體逐漸衰亡，導致侵入的線蟲不能繼續發育[37]。在植物受到外界生物或非生物刺激后，植物體內誘導表達的MYB轉錄因子調控植物防衛反應[25]，從擬南芥體內克隆的AtMYB44基因與植物對蚜蟲的抗性有關[26]。本研究中，UniGene JF951950在溫麥19和抗線2號中的表達量變化趨勢基本相當，推測該基因可能在線蟲侵染后植物早期的防衛反應和合胞體的建立階段發揮作用較??；而UniGene AK330737在抗線2號和溫麥19 中的表達差異較大，在溫麥19中，該基因在接種5 d 時相對表達量比接種 1 d時增加6倍左右，在接種后7 d 時，其表達量急劇下降，而在9 d時強烈增加；在抗線2號中，該基因在接種后3 d時，其表達量比接種后1 d時增加近12倍，之后各時段，其表達量變化不大，推測該基因可能參與線蟲侵染后植物的防御反應及在合胞體建立階段發揮作用。

圖3 菲利普孢囊線蟲侵染后在不同時段的表達特性Fig.3 A time-course expression patterns of genes after H.filipjevi inoculated

3.3 轉錄因子和信號轉導基因

信號轉導相關的基因往往在植物早期的防御反應發揮信號傳導作用。前人研究發現，小麥紋枯病菌、根腐病菌侵染小麥后誘導表達的TaPIM1基因在小麥中參與防御反應，轉入該基因的煙草對青枯病菌的抗性明顯增強[27]。本研究中的UniGene CD877975在溫麥19中隨接種后時間的延續其表達量呈逐漸增加趨勢，而在抗線2號中，則隨接種時間的延續，表達量呈逐漸降低趨勢，由此推斷該基因與小麥對菲利普孢囊線蟲的抗性密切相關。