烏拉爾圖小麥WOX基因的克隆與表達分析

單強強，陽文龍，李英潔，劉冬成， 孫家柱，張愛民，程西永

(1.河南農業大學農學院, 河南鄭州 450002; 2.植物細胞與染色體工程國家重點實驗室, 中國科學院遺傳與發育生物學研究所, 北京 100101)

WOX(WUSCHEL-relatedhomeobox)家族基因在植物胚胎發生、干細胞維護和根的形成等關鍵發育過程中起著重要作用[1]，其編碼蛋白是一類植物特有的轉錄因子，是同源異型結構域(Homeodomain, HD)蛋白Homeobox(HOX)超家族中的一員[2]。典型的HD包括60個氨基酸殘基，組成helix 1 -loop-helix2-turn-helix3的空間結構，起到與特異DNA序列結合的作用[3]。WOX蛋白家族的HD含有65個氨基酸殘基(WUS為66個)，屬于含有額外氨基酸殘基的非典型的HD[4]，HD下游還含有其他功能元件[5]。系統發育分析發現，WOX家族可分為3支：WUS支/進化支、中間支和古老支，WUS支成員WUS-box起始氨基酸為T-L，古老支和中間支起始氨基酸并不固定[5]。古老支的WOX成員只存在低等植物中，中間支在維管植物中開始出現，進化支的WOX成員僅存在高等植物中，其含有特異的WUS盒(T-L-X-L-F-P-X-X，其中X代表任何一個氨基酸)，表明中間支和進化支可能是經過古老支成員復制和分化形成的[6]。自1996年Laux等克隆得到了WUS基因以來，很多物種都已克隆到WOX家族基因；如擬南芥中有15個，水稻中有13個，玉米中有21個被鑒定[7-8]。擬南芥中，WUS支/進化支包括WUS和WOX1-WOX7，中間支包括WOX8、WOX9、WOX11和WOX12，古老支包括WOX10、WOX13和WOX14[5]。WUS和WOX5分別在莖尖分生組織(SAM)和根尖分生組織(RAM)的中心細胞中表達，具有維持干細胞分裂的功能[3,9-10]。此外，WUS還參與調控胚珠和花藥的發育[11-12]。WUS蛋白不僅可以作為抑制因子，而且在調控AG基因時起到了活化劑的作用[6]。研究表明，WUS/PGA6可能通過促進營養生長向胚胎發生的轉變或維持胚胎干細胞的屬性從而對胚胎發育起著重要作用[13]。WOX2和WOX8、WOX9均在合子中表達，與胚胎早期頂—基部分的形成相關[14]。WOX3/PRS1(PRESSED FLOWER1)主要在分生組織的外圍進行表達，對營養時期和生殖時期干細胞的表達調控有重要作用[15]。AtWOX4參與SAM和RAM中維管束的形成與發育[16]。AtWOX5在根尖不活動中心特異表達[5]，主要控制擬南芥RAM的活性[17]。WOX6/PFS2主要在胚珠中表達并調節胚珠的發育，在珠被和卵細胞的形成過程中防止細胞的提前分化[18]，WOX6可以影響冷脅迫的應答[19]。WOX13、WOX14在根部及花藥表達，并且受到嚴格調控，具有防止提前分化的功能[20]。

水稻WOX基因的表達模式和功能與擬南芥的WOX基因存在一定的差異，如OsWUS主要在幼苗時期的葉原基表達，特別是葉原基頂端，另外也在莖尖分生組織以及花序原基中表達，說明單子葉植物的水稻和雙子葉植物的擬南芥WUS基因的表達模式出現了分化[21]；AtWOX4與微管分生組織發育相關[16]，但其同源基因OsWOX4在微管豐富的葉片和根中沒有檢測到明顯的表達信號[22]，說明該基因在擬南芥和水稻的功能上存在一定程度的分化。

目前，小麥的WOX基因只克隆到2個成員：TaWOX2和TaWOX5s(包括TaWOX5a,TaWOX5b,TaWOX5c)，TaWOX2主要在種子發育過程中表達，TaWOX5s主要在小麥根和愈傷組織中表達，它們的染色體定位和具體功能還不清楚[23]。烏拉爾圖小麥是普通小麥 A 基因組的原始二倍體供體種，也是普通小麥進化的基礎性基因組，對普通小麥的發展和進化起著核心作用[24]。伴隨著小麥 A 基因組測序的完成，烏拉爾圖小麥因為具有基因組相對較小、遺傳背景簡單、遺傳多樣性高等優點而成為打破小麥研究瓶頸的新的切入點。因此，本研究以烏拉爾圖小麥為研究對象，以已知的水稻和擬南芥的WOX基因編碼蛋白搜索烏拉爾圖小麥的基因組數據庫，獲得候選WOX基因家族的蛋白序列、cDNA序列和DNA序列，對烏拉爾圖小麥中WOX基因進行同源克隆，并進行生物信息學分析、組織特異性和非生物逆境脅迫的表達分析，初步明確烏拉爾圖小麥WOX家族基因的組成類別、系統發生情況，以及在不同組織和不同逆境脅迫下的表達特性，以期為深入研究小麥WOX基因家族的結構、功能和表達調控模式等提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

供試材料為已進行基因組測序的烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)材料G1812，將其種植于 22 ℃、16 h光照/8 h黑暗的溫室條件下，生長兩周，取部分葉片用于DNA的提取；其余材料分別做以下處理：100 μmol·L-1ABA處理；置于 4 ℃冰箱進行低溫處理；室溫條件下自然脫水處理；用200 mmol·L-1NaCl進行高鹽脅迫處理。所有處理均為3 h；以未處理幼苗為對照，3次重復。采集各處理幼苗的葉片，液氮速凍，置于超低溫冰箱保存備用。

2013年9月底，播種烏拉爾圖小麥于中國科學院遺傳與發育生物學研究所北京昌平實驗農場；于2014年5月，烏拉爾圖小麥長至抽穗期，采集根、莖、旗葉和幼穗，液氮速凍，保存于超低溫冰箱用于RNA提取。

1.2 基因組DNA的提取及WOX基因的克隆

用CTAB法提取生長2周的烏拉爾圖小麥幼苗葉片的基因組DNA，用紫外分光光度計及0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質量，將DNA濃度調整為100 ng·μL-1。以其為模板，用WOX基因特異引物(表1)進行PCR，反應體系與程序參考LA Taq polymerase說明書，其中循環數為40，退火溫度為57 ℃，延伸時間為 2 min 30 s。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的DNA片段，用TIAN gel DNA Purification Kit(天根，北京)回收目的片段，用pGEM-T Easy載體連接試劑盒(Promega，美國)進行連接。連接產物采用熱激法轉化大腸桿菌，用菌落PCR篩選含有目的片段的陽性克隆，然后送至北京博邁德基因技術有限公司進行測序。

1.3 烏拉爾圖小麥總RNA的提取和cDNA第一鏈合成

用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN，德國)按照試劑盒說明書提取烏拉爾圖小麥材料的總RNA，用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和完整性。用FastQuant RT Kit (With gDNase)(天根，北京)進行cDNA第一鏈的合成，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.4 WOX基因序列的生物信息學分析

用DNAMAN Version 8和DNASTAR Lasergene v7.1對測序結果進行序列拼接和比對分析，用NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/docs/cdd_search.html)分析氨基酸序列的保守結構域，用ExPASy-ProtParam tool在線分析工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸序列的理化性質，用CBS-TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)進行跨膜結構域預測，用GenScript-PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)進行亞細胞定位預測，用CBS-SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預測。用GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行基因結構分析，用Clustal W(www.ebi.ac.uk/clustalw)或者DNASTAR Lasergene v7.1的Megalign進行蛋白序列比對分析，用MEGA6進行系統發育分析。

1.5 WOX基因的表達分析

以上述合成的cDNA為模板，用WOX基因特異引物(表1)，以小麥Ta4045(ubiquinol-cytochrome C reductase iron-sulfur subunit)基因為內參基因，用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術在Roche LightCycler 480 system(Roche，美國)參照LightCycler 480 SYBR Green 1 Master Kit(Roche，美國)說明書進行WOX基因的表達 分析。

表1 WOX基因克隆和定量表達分析所用引物Table 1 Primers used for WOX gene cloning and qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 TuWOX基因的克隆與序列分析

用已知的水稻和擬南芥WOX基因編碼蛋白序列，搜索小麥二倍體祖先種烏拉爾圖小麥的基因組數據庫，獲得候選WOX基因的蛋白序列、cDNA和基因組DNA序列。根據獲得的候選序列分別設計特異引物(表1)，以烏拉爾圖小麥基因組DNA為模板進行PCR，克隆得到6個基因，擴增長度分別為3 642、2 042、3 069、2 976、3 354和1 320 bp，包括部分5′和3′UTR和完整的CDS序列。用NCBI-CDD對其編碼氨基酸序列的保守結構域進行分析，發現6個基因的編碼氨基酸都含有與水稻、擬南芥及二穗短柄草高度相似的保守結構域(圖1，圖2)，說明從烏拉爾圖小麥中成功克隆得到6個WOX家族基因，分別命名為TuWOX1、TuWOX2、TuWOX3、TuWOX4、TuWOX5和TuWOX3a，并對這6個基因進行生物信息學分析。

圖1 TuWOX蛋白的氨基酸序列保守結構域Fig.1 Conserved domain of the deduced amino acid sequences of TuWOXs

將6個烏拉爾圖小麥TuWOX基因與水稻的13個WOX基因、擬南芥的15個WOX基因以及二穗短柄草的7個WOX基因同源異型結構域序列進行多重比對(圖2)，發現這四種植物WOX基因的同源異型結構域中保守氨基酸位點的分布非常相似。已有研究表明，同源異型結構域中存在著幾個保守的氨基酸位點，例如螺旋1(helixl)中的Q、L和Y，螺旋3(helix3)中的V、W、F、N[25]。在本研究中，我們發現WOX蛋白同源異型結構域中存在著其他的保守氨基酸殘基，包括螺旋1(helixl)中的R、W、P，螺旋2(helix2)中的P、I和L，螺旋3(helix3)中的Y、F、Q和N，以及轉角(turn)中的 G。同時發現，在環(loop)中存在可變的氨基酸殘基，而之前也有報道說明在一些非典型同源異型結構域蛋白的同源異型結構的環和轉角區域存在額外的氨基酸殘基[3,26-27]。

理化性質分析結果(表2)表明，6個基因所編碼的蛋白質的不穩定性指數和脂溶指數均大于50，總平均疏水性指數均為負值，故而都是不穩定的親水性脂溶蛋白，其中TuWOX2和TuWOX3a的等電點大于9，且堿性氨基酸殘基數遠大于酸性氨基酸殘基數，為堿性蛋白。跨膜結構預測分析發現，6個蛋白均不存在跨膜結構域，屬于非跨膜蛋白類。亞細胞定位預測結果表明，除TuWOX1定位于線粒體外，其余5個蛋白均定位于核內。信號肽預測結果表明，6個蛋白均不含信號肽。基因結構分析結果(圖3)表明，除TuWOX3a沒有內含子外，其他5個基因分別含有7、2、1、3和1個內含子。

2.2 WOX蛋白的系統發育分析

為研究烏拉爾圖小麥WOX基因的進化關系，用MEGA6軟件對6個烏拉爾圖小麥WOX蛋白序列進行了N-J (Neighbor-Joining)和L(Maximun-Likehood)兩種方法的系統發生分析，發現兩種方法構建的進化樹在整體上具有非常相似的拓撲結構，僅少部分節點有所區別。因此，以N-J法構建的進化樹(圖4)為例進行烏拉爾圖小麥WOX基因編碼蛋白的系統進化分析，發現TuWOX3a、TuWOX2和TuWOX3聚在了一支，TuWOX4和TuWOX5分別聚在了另外兩支，而TuWOX1為單獨一支。前人研究認為擬南芥WOX蛋白大致可以分為三個系統進化支，分別為包括WUS、WOX1、WOX2、WOX3、WOX4、WOX5、WOX6和WOX7的WUS支，包括WOX8、WOX9、WOX11和WOX12的中間支，以及包括WOX10、WOX13和WOX14的古老支[5-6]。因此，TuWOX3a、TuWOX2和TuWOX3屬于WUS支，TuWOX4屬于古老支，TuWOX5屬于中間支，除了這三個分支外，TuWOX1自成一支，說明在烏拉爾圖小麥中可能出現了不同功能的WOX家族基因。

At：擬南芥；Bd：二穗短柄草；Os：水稻；Tu：烏拉爾圖小麥。

At:Arabidopsisthaliana; Bd:Brachypodiumdistachyon; Os:Oryza sativa; Tu:Triticumurartu.

圖2 WOX蛋白同源異型結構域的比對分析

圖3 TuWOX基因結構分析Fig.3 Structure of TuWOX genes

2.3 TuWOX基因的表達分析

2.3.1TuWOX基因的組織表達模式分析

為研究6個TuWOX基因在組織中的表達模式，本研究設計了基因特異引物，對烏拉爾圖小麥抽穗期的幼穗、莖、旗葉和根進行qRT-PCR。結果(表3)表明，TuWOX基因在各個組織中均為組成性表達，但在不同組織中的表達量有差異，其中，TuWOX1、TuWOX3、TuWOX4、TuWOX5和TuWOX3a均在根中表達量最高，TuWOX2在莖中的表達量最高，說明其在調控植物生長的過程中所起到的作用及參與的機制可能不同。另外，TuWOX4在根、莖、葉、穗中的表達水平均較高，TuWOX1在根和葉中的表達水平較高，其余基因在各組織中的表達量均很低。同時，這6個基因在穗中的相對表達都較低，表明WOX家族基因可能對穗的生長發育作用不大，或沒有直接作用。

表3 TuWOX基因在不同組織中的表達量Table 3 Expression profiles of the TuWOX genes in different tissues

表中同一列數據后的不同大寫字母表示不同組織之間的差異達到極顯著水平(P<0.01)。

The different captain letters following the values represent the expression difference in different tissues are highly significant (P<0.01).

圖4 烏拉爾圖小麥TuWOX與其他植物的WOX蛋白的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of TuWOXs and WOX proteins from other plants

2.3.2 不同脅迫條件下TuWOX基因的表達 分析

對烏拉爾圖小麥6個TuWOX基因在ABA、低溫、干旱和高鹽脅迫條件下的表達水平進行了分析，結果(表4)表明，TuWOX1在低溫脅迫下表達量有所增加，而在干旱及高鹽條件下表達量顯著降低；TuWOX2在四種脅迫條件下，表達量均顯著降低；TuWOX3在低溫和干旱脅迫條件下表達量都顯著增加；TuWOX4在干旱脅迫下表達量顯著增加，而在低溫、高鹽及ABA處理下表達量顯著降低；TuWOX5及TuWOX3a在植株體內表達水平較低，TuWOX5在四種脅迫條件下，表達量均降低；TuWOX3a在低溫、干旱和高鹽條件下表達量顯著降低。

表4 TuWOX基因在不同脅迫條件下的表達模式Table 4 Expression profiles of the TuWOX genes under different stresses

表中同一列數據后的不同大寫字母表示不同處理之間的差異達到極顯著水平(P<0.01)。

The different captain letters following the values represent the expression difference in different treatments are highly significant(P<0.01).

3 討 論

本研究通過同源克隆，獲得6個烏拉爾圖小麥WOX家族基因，分別命名為TuWOX1、TuWOX2、TuWOX3、TuWOX4、TuWOX5和TuWOX3a。它們都具有一個同源異性結構域，通過同源異性結構域的分析可以確定這6個基因屬于WOX基因家族。

系統發育分析表明，TuWOX2與OsWOX4及AtWOX4親緣關系最近。表達模式分析發現，TuWOX2在根部的表達量較高。據報道，擬南芥AtWOX4基因主要參與SAM與RAM維管束的發育與形成，并且AtWOX14在調節維管細胞分裂上與AtWOX4具有冗余的功能[28]。突變體研究發現TDIF-TDR-WOX4信號在擬南芥次生生長過程中的維管分生組織的維持具有重要角色[29]。推測TuWOX2也可能具有類似的功能。

TuWOX3與水稻中親緣關系最近的是OsWOX9，與擬南芥中AtWOX5、AtWOX7關系較近，屬于WUS支/進化支。擬南芥中WUS支除了AtWOX7沒有WUS盒外，其他都具有WUS盒，在烏拉爾圖小麥中克隆的這6個基因中，TuWOX2、TuWOX3a、TuWOX3屬于WUS支，都具有WUS盒。將這6個基因與小麥中已克隆的TaWOX2和TaWOX5比對分析發現，這6個基因與TaWOX2的親緣關系較遠，而TuWOX3與TaWOX5同源性最高，氨基酸序列一致性達98%。TaWOX2主要在種子發育過程中表達，而TaWOX5主要在根和愈傷組織中表達[23]，TuWOX3在根和莖中的表達量較高，表明TuWOX3可能具有類似TaWOX5的功能。在擬南芥的發育中，AtWOX5在根尖不活動中心特異表達[5]，WOX5與WUS在根干細胞調節中的功能可以互相改變[9]；玉米(Zeamays)中根的發育與ZmWOX5基因的表達密切相關。玉米基因組中含有兩個WOX5同源基因ZmWOX5A和ZmWOX5B。ZmWOX5B基因在根端靜止中心表達，被認為是與擬南芥WOX5基因同源的基因。ZmWOX5B基因最早被發現在原胚維管化的胚柄細胞上層的胚的中部區域表達，而此時，ZmWOX5A基因早已在胚的近軸一側表達。在胚胎發育的后期，ZmWOX5B基因則集中于根的靜止中心處的細胞中表達。本研究克隆的烏拉爾圖小麥TuWOX3在根和莖中的表達量較高，說明TuWOX3有可能在這些組織中具有一定的功能。

TuWOX5與水稻中OsWOX11親緣關系較近，屬于中間支。水稻OsWOX11基因在SAM和RAM中表達，它的功能是控制不定根的形成，并主要作為一個生長素和細胞分裂素的響應因子[29]。TuWOX5的主要表達部位是根部，推測TuWOX5可能也起著相似的功能。

TuWOX4與AtWOX13、OsWOX8同屬于古老支，推測在功能上可能也有著相似的作用。在擬南芥中，WOX13和WOX14在主根和側根以及花藥中表達，它們具有防止提前分化的功能[20]，AtWOX13功能缺失突變體表現出胚座框變小的表型[30]。對TuWOX4的表達模式研究也發現，TuWOX4在根中的表達量相對其他組織較高。

TuWOX3a與OsWOX2親緣關系最近，與OsWOX3及AtWOX3屬于同一個子進化支，OsWOX2基因主要在水稻幼嫩組織中細胞分裂旺盛的區域表達，在發育早期的胚、莖端分生組織和根端分生組織干細胞以外區域、葉原基、莖居間分生組織及幼嫩花器官中均檢測到OsWOX2基因mRNA的大量積累，當器官逐漸發育成熟，OsWOX2基因的表達水平則逐漸降低。OsWOX2基因抑制表達影響了水稻植株葉片的形態發生，促進了水稻莖居間分生組織的活動，且抑制了花器官的正常發育過程[29]。OsWOX3在分生組織及葉原基中表達，并且調控葉片的發育，RNAi干擾的植株葉片呈現卷曲表型，OsWOX3超量表達的水稻植株中，葉片變寬[31]。TuWOX3a主要在根及葉中表達，推測TuWOX3a對根與葉片的發育是有一定作用的。

TuWOX1與擬南芥、水稻中所報道的WOX基因親緣關系較遠，推測TuWOX1可能在小麥中功能出現了較大分化，從TuWOX1在不同組織的表達分析中可以看出，TuWOX1在根和葉中表達量較高，而在莖和穗中表達量較低，表明TuWOX1可能在根與葉中發揮了一定的作用，其具體功能需要進一步的研究。