水飛薊賓對0J小鼠致肝損傷的改善機制研究

楊雨佳 羅赤苗 陳嘉勤 彭琦

【摘要】探討水飛薊賓通過iNOS/NF-KB信號通路對梗阻性黃疸小鼠肝細胞修復與再生的作用機制。構建小鼠梗阻性黃疸模型20只，隨機分成模型組（M）、藥物組（S）、空白組（S0）。發現構模小鼠皮膚黃染嚴重，肝索紊亂，血液中總TBIL及AST超標，出現空泡及核裂變，iNOS、NF-KB、TNF-a、Par-4mRNA表達上升。S組有較明顯改善。提示水飛薊賓能增強梗阻性黃疸致肝損傷后小鼠的免疫功能及肝細胞的修復能力，其機制可能是通過調控iNOS/NF-KB通路相關細胞因子表達和保持肝細胞的完整性。

【關鍵詞】水飛薊賓;阻塞性黃疸致肝損傷;iNOS/NF-KB;TNF-α;小鼠

1前言

由于各種因素導致肝內外膽管阻塞引起膽汁流通障礙是梗阻性黃疸發生的主要原因。水飛薊賓是從罕見的菊利植物水飛薊果實中提取分離的黃酮類化合物，能保證肝細胞膜的完整性和修復性。在病理情況下iNOS表達顯著升高產生NO，造成細胞代謝障礙及增強炎癥反應。聯合NF-KB能調控組織損傷中多種炎癥介質的編碼基因。本研究以阻塞性黃疸構建小鼠肝損傷模型，通過水飛薊賓干預，觀察肝組織iNOS、NF-KB、TSF-α、Par-4的表達，探討其在阻塞性黃疸致肝損傷、修復相關機制，為相關疾病研究提供理論和實驗依據。

2材料與方法

2.1實驗對象及模型構建

健康昆明種雄性小鼠30只，構建小鼠梗阻性黃疸模型20只，隨機分成模型組（M）、藥物組（S），設空白組（SO）10例。水飛薊賓灌胃：按人與小鼠體表面積折算等效劑量經口灌胃，每天（下午4時）灌胃一次，劑量0.4mL/次（濃度為30mg/kg），7d/w，共7周。構模：腹腔注射異戊巴比妥（500mg/kg）進行麻醉。腹部劍突下1cm進行局部消毒，并剪去毛發。眼科剪縱向開l.2cm手術切口，暴露肝臟，棉絮棒輕微撥開肝葉，暴露膽總管，玻璃分針進行分離，4-0不可吸收手術線將其成90。彎曲懸掛于腹壁，縫合切口。

2.2一般情況及血生化觀察

對所有小鼠肝臟形態、排泄物、活動狀態等進行綜合性評價。血清中總膽紅素（TBIL）和谷草轉氨酶（AST）含量檢測按照說明書操作步驟在半自動生化分析儀上進行。

2.3病理學切片

取厚3.0mm石蠟切片，脫蠟、脫水，HE染色，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡（X²00）下觀察肝臟組織形態學。

2.4肝組織iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4mRNA檢測

總mRNA提取采用動物組織RNAprepPure Tissue Kit試劑盒;并按說明書進行操作。儀器：ABI 7900HT，試劑：SYBRPremix Ex Taq^TM（Takara）試劑盒。按說明書進行操作，引物合成設計由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。

2.5統計學處理

采用中文SPSS20.0軟件進行統計學分析，并采用SigmaPlotl0.0軟件作圖，數據統計以平均數±標準差（x±s）來表示，組間對比分析采用單因素方差分析方法，若P<0.05表示為具有顯著統計學意義，若P<0.01表示為具有非常顯著統計學意義。

3結果與分析

3.1一般行為學及生化檢測

SO組小鼠肝臟顏色紅潤，質地柔軟。M組呈暗褐色，顯現顆粒狀突起且興奮性降低，糞便呈現蒼白色。S組癥狀有明顯好轉。血生化結果表明，與M（84.34±9.07）相比，S組的血清ALT（50.18±7.61）含量顯著下降（P<0.01）。TBIL含量M組（27.25±4.92）明顯高于s組（7.64±4.18），具有非常顯著性差異（P<0.01）。

3.2HE染色

肝組織HE染色發現：M組肝索結構紊亂，存在大量核固縮、空泡，甚至消失。肝小葉破壞顯著，細胞質基質斑狀聚集。相比M組，S組肝小葉損傷緩解，有少量空泡，肝索結構清晰可見。SO組無明顯病變癥狀。

3.3qRT-PCR結果

qRT-PCR檢測結果，肝組織中iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4mRNA表達在M組中表達最高，S組相對降低（P<0.01）;相比S組，SO組各因子mRNA表達明顯下降（P<0.01）。

4討論

梗阻性黃疸疾病的主要原因是肝內外膽管完全或不完全阻塞，導致膽汁淤積所致。其表現為膚色、鞏膜出現黃染，血清總膽紅素明顯增加。抑制炎癥反應的發生，降低炎性因子的釋放，促進機體免疫功能的恢復，防止誘發其它并發癥是治療梗阻性黃疸病致肝損傷的首要目標，在科研實驗中能較好模擬人類梗阻性黃疸發病機制的動物模型成為研究的關鍵。本實驗采用昆明小鼠作為研究對象，懸掛膽總管造成膽管阻塞構建梗阻性黃疸模型，構模后小鼠腹部等多處出現黃染，血清總膽紅素等多項生化指標超標。故判斷模型構建成功，并應用于本研究。

目前，調控細胞因子與免疫系統的關系受到研究者們的關注。梗黃的發生可促進相關炎性細胞因子的超負荷釋放，增強炎癥反應的發生，復雜的免疫系統，調控或抑制單一炎癥介質無法有效影響整個免疫介質網絡。故尋找炎癥反應上游重要調控因子，并清楚各因子間的作用機制，才能得到有效的干預效果。梗黃致肝損傷后促使活化的白細胞聚集于肝組織微血管，激活大量炎性介質，同時中性粒細胞募集，增強炎癥反應的發生NF-KB能調控組織損傷中多種炎癥介質的編碼基因，加重炎癥反應。聯合iNOS可產生劇烈細胞毒性效果，本實驗中，肝組織iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4mRNA表達顯著增多，提示小鼠肝組織炎癥反應增強，S組iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4蛋白及mRNA相比M組降低顯著，提示7周水飛薊賓灌胃可減輕或緩解肝損傷。

5結論

水飛薊賓能緩解或減輕梗阻性黃疸小鼠肝損傷的進一步擴張，其機制可能通過調節iNOS/NF-KB信號通路，加強梗黃小鼠免疫及抗炎能力，促進肝細胞修復與再生。