復方芪藻湯調控FoxO3a/FasL/Caspase8抑制實驗性胃潰瘍大鼠胃黏膜上皮細胞凋亡

陳暢 隋璐 趙春瑩

(沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110034)

胃潰瘍可由幽門螺桿菌感染、藥物、激素、應激、不良生活習慣等多種原因誘發(fā)，臨床上主要表現(xiàn)為節(jié)律性、周期性、易復發(fā)性上腹痛，常可導致出血、穿孔、甚至癌變。胃潰瘍可發(fā)生于任何年齡，中老年人群中更為多見，男性患者多于女性〔1,2〕。當前治療胃潰瘍的常規(guī)療法即三聯(lián)療法正面臨著用藥周期長、愈合不完善、長期給藥對肝腎毒副作用大、停藥易復發(fā)的問題。與之相比，中醫(yī)藥在治療胃潰瘍方面具有獨特的優(yōu)勢。復方芪藻湯(FFQZT)是一味針對潰瘍病脾胃虛寒病機的中藥方劑，具有高治愈率、低副作用、同時價格低廉的優(yōu)點。但FFQZT的作用機制尚不明確。本研究擬通過外源性凋亡通路叉頭框蛋白(Fox)O3a/人凋亡相關因子配體(FasL)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白配(Caspase)8探討FFQZF修復胃黏膜損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重180～220 g，購自遼寧長生生物技術有限公司，動物合格證號為SCXK(遼)2015-0001。適應性飼養(yǎng)2 w，自由進食、飲水。

1.2 實驗藥物 FFQZT(螺旋藻多糖18 g，黃芪20 g，白芨15 g，烏賊骨10 g)購自沈陽國大藥房。奧美拉唑腸溶膠囊購自悅康藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)(批號14370242)。

1.3 主要試劑與儀器 兔抗大鼠FoxO3a單克隆抗體(CST)，兔抗大鼠FasL多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase8多克隆抗體(武漢博士德生物技術有限公司)，兔抗大鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體、山羊抗兔二抗(上海索萊寶生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測量試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)試劑盒、超敏電化學發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術公司)，鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶鏈接法(SP)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中杉金橋生物技術有限公司)。低溫超速離心機(德國Heraeus Sepatech公司)，ELx800酶標儀(美國BioTek公司)，Bio-Rad 電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，石蠟切片機(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)。

1.4 動物分組與模型制備 將大鼠隨機分為空白組、模型組、FFQZT低劑量組、FFQZT中劑量組、FFQZT高劑量組、奧美拉唑組各10只。采用乙酸燒灼法制備胃潰瘍模型。空白組不做處理，其余各組均以3%戊巴比妥鈉麻醉。麻醉后，常規(guī)剪毛并消毒手術區(qū)，自劍突下沿腹中線稍左做約2 cm的切口，自肝后牽引出胃，在胃前壁胃竇與胃體交界處，貼附浸泡了冰醋酸的濾紙片，共貼附2次，每次30 s。吸去殘留乙酸，用大網(wǎng)膜覆蓋后將胃送回腹腔，逐層縫合腹壁。術后1 d內禁食。自造模成功后第3天開始灌胃，空白組及模型組給予1 ml/100 g生理鹽水灌胃；FFQZT低、中、高劑量組分別給FFQZT 3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg，奧美拉唑組給奧美拉唑水溶液3.6 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

1.5 標本采集 大鼠第14天灌胃后，禁食不禁水24 h，次日處死取材。處死后開腹取胃，沿較大曲率剪開，用冰生理鹽水沖洗胃腔后，在冰袋上展平胃部。將潰瘍灶及其周邊3 mm范圍內的組織切下，組織塊大小為1.0 cm×1.1 cm，均分為兩部分。一部分迅速投入液氮中-80℃凍存，備做Western印跡檢測；另一部分4%多聚甲醛固定1 d，制成蠟塊，備做免疫組化染色。

1.6 Western印跡檢測FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表達 每個樣品剪取約20 mg的組織，充分裂解后，4℃下14 000 r/min離心5 min，取上清液，用BCA檢測試劑盒測定蛋白濃度并計算上樣量。將煮好的蛋白加入10%SDS-PAGE中，以120 V 電泳1 h。電泳結束后取出凝膠，加入轉膜液，轉膜條件是250 mA下轉膜90 min。室溫下用脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃過夜(FoxO3a 1∶1 000、FasL 1∶1 500、Caspase8 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000)，二抗室溫1 h(羊抗兔免疫球蛋白G1∶10 000)，超敏電化學發(fā)光液曝光。Image J測定曝光條帶灰度值。

1.7 免疫組化法檢測大鼠胃黏膜上皮中FoxO3a、FasL、Caspase8的表達 4 μm切片常規(guī)脫蠟至水，乙二胺四乙酸(EDTA)微波修復后按SP試劑盒說明書進行染色，以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對照。陽性指標為細胞核或細胞質呈棕褐色。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野，根據(jù)染色強度與陽性細胞數(shù)采用評分法進行評估，結果取均值〔3〕。根據(jù)染色強度計分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據(jù)陽性細胞數(shù)計分：無陽性細胞0分， ≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。將染色強度計分與陽性細胞數(shù)乘積為評估標準，乘積≥4分為陽性。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1 Western印跡法檢測FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表達 模型組FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白水平明顯高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，F(xiàn)FQZT高劑量組Foxo3a、FasL、Caspase8蛋白水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)FQZT低、中劑量組Foxo3a、FasL蛋白和FFQZT低劑量組Caspase8蛋白差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

1～6：空白組、模型組、FFQZT低劑量組、FFQZT中劑量組、FFQZT高劑量組、奧美拉唑組圖1 Western印跡法檢測Foxo3a、FasL、Caspase8蛋白表達

組別FoxO3aFasLCaspase8空白組0.65±0.141)0.57±0.111)0.46±0.141)模型組1.06±0.321.29±0.311.14±0.29FFQZT低劑量組0.97±0.320.96±0.300.99±0.37FFQZT中劑量組0.90±0.190.89±0.490.82±0.271)FFQZT高劑量組0.71±0.101)0.77±0.331)0.61±0.231)奧美拉唑組0.85±0.201)0.80±0.171)0.78±0.141)

與模型組相比：1)P<0.05

2.2 免疫組化法檢測大鼠胃黏膜上皮中FoxO3a、FasL、Caspase8的表達 免疫組化結果顯示FoxO3a表達位點位于細胞核(圖2)，F(xiàn)asL、Caspase8表達位點位于細胞質(圖3、圖4)。各組FoxO3a、FasL、Caspase8表達水平存在明顯差異(P<0.01)。空白組少見FoxO3a、FasL、Caspase8陽性細胞；模型組可見大量FoxO3a、FasL、Caspase8陽性細胞，染色范圍廣且染色強度較深；與模型組相比，F(xiàn)FQZT中、高劑量組及奧美拉唑組Foxo3a、FasL、Caspase8陽性表達均下降，而與奧美拉唑組相比，F(xiàn)FQZT高劑量組FoxO3a、FasL、Caspase8表達下降最明顯，見表2。

圖2 FoxO3a在大鼠胃黏膜上皮表達情況(×400)

圖3 FasL在大鼠胃黏膜上皮表達情況(×400)

圖4 Caspase8在大鼠胃黏膜上皮表達情況(×400)

組別FoxO3a陰性陽性FasL陰性陽性Caspase8陰性陽性空白組9110091模型組191919FFQZT低劑量組193719FFQZT中劑量組465546FFQZT高劑量組917382奧美拉唑組827364χ2/P值29.676/<0.0121.715/<0.0123.767/<0.01

3 討 論

FFQZT是一味抗?jié)兣c養(yǎng)胃兼用的中藥方劑，具有降低胃液胃酸分泌、促進潰瘍愈合、保護胃黏膜、提高機體免疫功能的作用。研究表明螺旋藻多糖對大鼠實驗性胃潰瘍有促進潰瘍愈合、保護胃黏膜的作用〔4〕。黃芪具有補氣升陽，益固表衛(wèi)，利水消腫，托瘡生肌之功效，還能增強機體免疫功能，促進細胞代謝，且黃芪與黃芪提取物對幽門螺桿菌有直接殺滅的作用〔5〕;烏賊骨可制酸止痛、收濕斂瘡,其成分碳酸鈣具有中和胃酸、促進潰瘍面炎癥吸收的作用，與抗生素聯(lián)合應用可降低不良反應和耐藥性〔6〕;白及具有高黏度性，口服后可在胃黏膜表面形成一層保護膜,阻止胃酸、胃蛋白酶及其他理化因素對潰瘍的進一步侵襲,同時發(fā)揮收斂、止血的功效，有利于潰瘍的愈合及修復〔7〕。

胃潰瘍的致病機制尚未完全明確，但已有研究證實，胃黏膜上皮細胞凋亡在胃潰瘍發(fā)生與愈合中均有重要作用〔8〕。細胞凋亡是細胞的程序性死亡方式，這個過程與細胞增殖、分化共同貫穿于生命的始終，是生命體正常生長、發(fā)育與死亡所不可缺少的。細胞凋亡的途徑有兩種，分別是由死亡受體起始的外源性途徑和線粒體起始的內源性途徑。

FoxO3a屬于Forkhead家族中的O亞族，是該家族的核心蛋白，在各組織器官中均有廣泛表達。作為細胞生命活動的重要參與者，F(xiàn)oxO3a在細胞凋亡、氧化應激、細胞周期等過程中都起著關鍵性作用，其中最主要的功能是調控細胞凋亡〔9〕。FoxO3a的活性受其上游因子調控，蛋白激酶B(Akt)、血清/糖皮質激素調節(jié)激酶(SGKs)、IKB激酶(IKK)等因子可抑制FoxO3a活性，c-Jun氨基末端激酶(JNK)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等因子可增強FoxOsa活性。當抑制性因素作用于FoxO3a時，會將其磷酸化，磷酸化的FoxO3a與DNA的親和力下降，與細胞核內的14-3-3核輸出蛋白結合，發(fā)生核排斥，F(xiàn)oxO3a會被移出細胞核轉移到細胞質中，泛素化降解，喪失轉錄活性，從而失去控制細胞凋亡的能力；當抑制性因素作用于FoxO3a時，會促使去磷酸化的FoxO3a轉移到細胞核，激活下游凋亡相關因子，介導細胞凋亡〔10,11〕。

FasL是FoxO3a下游的靶蛋白，是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的重要成員，在外源性凋亡通路中起重要的作用，主要表達位點在T細胞。FasL和Fas常相互配合，在細胞膜上形成誘導凋亡的復合體，該復合體可吸引細胞質中與帶有相同死亡結構域蛋白的FADD結合，激活Caspase家族〔12〕。Caspase家族主要包括凋亡啟動因子、凋亡執(zhí)行因子和炎癥介導因子。Caspase8是凋亡啟動的核心，F(xiàn)asL與 Caspase8結合后，使Caspase8活化，活化的Caspase8可以引起Caspase凋亡級聯(lián)反應，破壞細胞內死亡結構蛋白及功能蛋白，最終激活凋亡執(zhí)行的關鍵蛋白Caspase3，引起細胞凋亡〔13,14〕。

本研究中，模型組FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表達明顯高于空白組，而在應用了FFQZT后凋亡相關蛋白 FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表達明顯下降。綜上，F(xiàn)FQZT可能是通過調控FoxO3a/FasL/Caspase8通路從外源性途徑抑制細胞凋亡，從而發(fā)揮修復胃黏膜的作用。