廣寄生對(duì)糖尿病小鼠肝臟的保護(hù)作用及機(jī)制

羅澤萍 潘立衛(wèi) 李麗

(1河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 河池 546300；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室)

2型糖尿病(T2DM)是一組以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，最新的流行病學(xué)研究顯示我國(guó)大約11%的人口患有糖尿病，并呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)〔1〕。糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率、致殘率和致死率極高，?？衫奂罢{(diào)節(jié)糖脂代謝的肝臟，導(dǎo)致肝損傷和功能障礙，甚至演變?yōu)楦斡不蚋伟?〕。因此，改善糖尿病引起的肝損傷及促進(jìn)肝損傷的修復(fù)在治療糖尿病及減少并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。中草藥對(duì)于慢性病的治療，具有西藥無(wú)法比擬的作用溫和持久、多靶點(diǎn)、副作用小及減少并發(fā)癥發(fā)生的優(yōu)點(diǎn)而成為降血糖藥物研究的寶貴資源。廣寄生為桑寄生科，鈍果寄生屬植物。具有治療腰膝酸軟、風(fēng)濕痹痛、胎漏、胎動(dòng)及降血壓等功效〔3〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桑寄生科植物具有抗腫瘤、降血脂、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化及加快消耗HepG2細(xì)胞葡萄糖等作用〔4～10〕，而有關(guān)桑寄生科植物降血糖作用的研究甚少，本研究旨在探討桑寄生科植物廣寄生對(duì)T2DM小鼠肝臟的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK(桂)2014-0002。

1.1.2 藥物 廣寄生采摘于廣西河池市宜州區(qū)郊外，經(jīng)河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定為廣寄生(寄主為桑樹(shù))的莖葉，藥物提取方法：廣寄生50℃烘干，粉碎成粗粉。取粗粉5 kg，依次用95%乙醇、60%乙醇滲漉提取，各收集10倍量(體積)滲漉液，滲漉液合并，減壓回收乙醇，得總提取物浸膏約614.3 g，4℃冰箱保存，備用。

1.1.3 主要儀器 XL-300全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)歐霸ERBA公司)；xMark酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司)；DH-20F臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙百諾克離心機(jī)儀器有限公司)；AUW220D分析天平(日本島津公司)；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng))。

1.1.4 主要試劑 葡萄糖測(cè)定試劑盒(長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，2017033)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒(長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，2017007)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒(長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，2017022)；總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20171218)；三酰甘油(TG)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20171216)；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma，S0130)；堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20171221)；超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20171218)；白細(xì)胞介素(IL)-2、4、12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA)試劑盒、γ-干擾素ELISA試劑盒、B細(xì)胞淋巴瘤因子(Bcl)-2 ELISA試劑盒、Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)ELISA試劑盒、血紅素氧合酶(HO)-1 ELISA試劑盒、Toll樣受體(TLR)-4 ELISA試劑盒、核因子(NF)E2相關(guān)因子(Nrf2)ELISA試劑盒、NF-κB亞基p65親和肽(NF-κBp65)ELISA試劑盒及過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)-α ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司；201804)。

1.2 方法

1.2.1 T2DM小鼠肝損傷模型制備 高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 w后，連續(xù)7 d腹腔注射STZ 45 mg/(kg·d)。7 d后，檢測(cè)空腹血糖(FBG)≥12 mmol/L視為高血糖模型形成。T2DM繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 w后，檢測(cè)肝臟功能指標(biāo)變化，與空白對(duì)照組相比，以ALT、AST及ALP活性明顯升高(P<0.05)，確定T2DM小鼠肝損傷模型建立。

1.2.2 分組及給藥 隨機(jī)把T2DM肝損傷小鼠分為5組，分別為陽(yáng)性對(duì)照組〔二甲雙胍150 mg/(kg·d)+聯(lián)苯雙酯150 mg/(kg·d)〕、模型對(duì)照組(等體積生理鹽水)、廣寄生高劑量組〔36 g/(kg·d)〕、中劑量組〔18 g/(kg·d)〕及低劑量組〔9 g/(kg·d)〕各12只。另設(shè)空白對(duì)照組(等體積生理鹽水)小鼠12只。藥物或生理鹽水灌胃4 w末，摘眼球取血后，立即解剖取肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗3次后置-80℃冰箱保存。

1.2.3 血清相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定血清FBG、TC、TG、ALT、AST、ALP、SOD、MDA及T-AOC水平。

1.2.4 肝組織相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)制備肝組織勻漿測(cè)定IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、Bcl-2、BAX、HO-1、TLR4、Nrf2、NF-κBp65及PPAR-α的含量。

1.2.5 肝細(xì)胞觀(guān)察 肝組織經(jīng)過(guò)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色之后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 血糖、血脂測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組FBG、TC及TG均明顯升高(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組、廣寄生高、中、低劑量組FBG、TC及TG均較模型對(duì)照組顯著降低(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 廣寄生對(duì)T2DM小鼠血糖、血脂的影響

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型對(duì)照組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

2.2 肝功能指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組ALT、AST及ALP均明顯升高(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組、廣寄生高、中及低劑量組ALT、AST及ALP均明顯低于模型對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 廣寄生對(duì)T2DM小鼠肝功能指標(biāo)的影響

2.3 抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組MDA值明顯升高，而SOD和T-AOC活性明顯降低(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組、廣寄生高、中及低劑量組MDA值較模型對(duì)照組明顯下降、SOD和T-AOC活性明顯升高(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 廣寄生對(duì)T2DM小鼠抗氧化能力的影響

2.4 免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組IL-2、IL-4值明顯降低，IL-12、IFN-γ值明顯升高(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組、廣寄生組IL-2、IL-4值較模型對(duì)照組明顯升高，IL-12、IFN-γ明顯降低(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 廣寄生對(duì)T2DM小鼠肝細(xì)胞因子的影響

2.5 肝細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組Bcl-2、HO-1、Nrf2、PPAR-α值顯著降低，Bax、TLR4、NF-κBp65顯著升高(均P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、廣寄生組Bcl-2、HO-1、Nrf2、PPAR-α值明顯升高，Bax、TLR4、NF-κBp65值明顯降低(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 廣寄生對(duì)T2DM小鼠肝細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響

2.6 小鼠肝細(xì)胞 HE 染色圖 空白對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞分界清晰，大小均勻，細(xì)胞核圓而清晰。模型對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，肝組織有大量空泡，細(xì)胞核固縮。陽(yáng)性對(duì)照組和廣寄生高、中、低劑量組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂明顯改善，不同程度的減輕糖尿病小鼠肝臟病理改變。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肝細(xì)胞HE染色(×40)

3 討 論

長(zhǎng)期高血糖應(yīng)激導(dǎo)致體內(nèi)的葡萄糖和脂肪酸不能被很好利用，致使多余的葡萄糖和脂肪酸在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變成脂肪，脂肪在肝內(nèi)的沉積導(dǎo)致肝損傷，嚴(yán)重者可轉(zhuǎn)變?yōu)楦卫w維化、肝硬化甚至肝癌，因此對(duì)糖尿病肝損傷的干預(yù)十分重要。機(jī)體血糖升高時(shí)，肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成也增加，血清TC、TG增高均多見(jiàn)于糖尿病患者〔11〕。本研究表明廣寄生具有降血糖的作用，其降血糖作用可能與改善T2DM小鼠脂代謝紊亂有關(guān)。ALT、AST及ALP存在肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝臟受到損傷或者出現(xiàn)功能障礙時(shí)，便釋放到血液中導(dǎo)致血清ALT、AST及ALP升高〔12〕。本研究結(jié)果說(shuō)明廣寄生對(duì)T2DM造成的肝損傷有一定的保護(hù)作用。糖尿病患者內(nèi)分泌紊亂會(huì)導(dǎo)致活性氧(ROS)代謝失調(diào)，體內(nèi)過(guò)多的ROS是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥和細(xì)胞損傷的重要因素〔13〕。本研究結(jié)果說(shuō)明廣寄生能提高T2DM小鼠抗氧化能力從而在一定程度上減少T2DM并發(fā)癥的發(fā)生。細(xì)胞因子是T2DM發(fā)病的重要促進(jìn)因子，INF-γ對(duì)胰島β細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒性作用，而IL-4具有促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分化，對(duì)自身免疫性糖尿病有很強(qiáng)的保護(hù)作用〔14〕。IL-12水平升高可加重胰島素抵抗同時(shí)可直接影響β細(xì)胞增殖、分化和IFN-γ產(chǎn)生〔15〕，IL-2因促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，刺激抗體合成而發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用〔16〕。糖尿病患者常因免疫功能低下而并發(fā)感染，因此，提高機(jī)體免疫功能，在減少并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，廣寄生能降低T2DM小鼠肝細(xì)胞INF-γ、IL-12值，升高IL-2、IL-4水平，以提高免疫功能，對(duì)防治T2DM感染具有重要意義。細(xì)胞凋亡受到細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，而凋亡蛋白又分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類(lèi)。Bcl-2、Bax分別發(fā)揮抗凋亡和促凋亡作用，兩者的比值決定著細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn)廣寄生具有增強(qiáng)T2DM小鼠的Bcl-2轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)降低Bax轉(zhuǎn)錄活性。HO-1通過(guò)抗炎、抗凋亡、抗老化及改善微循環(huán)而起到保護(hù)細(xì)胞內(nèi)源性蛋白的作用〔18〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)廣寄生具有增強(qiáng)T2DM小鼠肝組織的HO-1活性作用，表明廣寄生的降糖保肝作用可能與增強(qiáng)肝組織HO-1活性有關(guān)。在高血糖狀態(tài)下，TLR4作為機(jī)體炎性反應(yīng)鏈的啟動(dòng)蛋白促使炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致使肝細(xì)胞受損、凋亡及功能障礙〔19〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)廣寄生能降低T2DM小鼠肝組織TLR4含量，從而降低糖尿病性肝炎或肝損傷的發(fā)生。持續(xù)的高血糖會(huì)誘發(fā)ROS產(chǎn)生，過(guò)多的ROS導(dǎo)致胰島素抵抗。Nrf2可以減少ROS的產(chǎn)生，減少由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的自噬性胰島β細(xì)胞凋亡從而改善由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗〔20〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)廣寄生能升高T2DM小鼠肝組織Nrf2含量，說(shuō)明廣寄生的保肝作用與增強(qiáng)Nrf2轉(zhuǎn)錄活性改善胰島素抵抗的作用有關(guān)。NF-κB與糖尿病患者胰島細(xì)胞的增殖和凋亡關(guān)系密切，p65蛋白作為NF-кB通路蛋白家族的重要組分能加速炎癥基因表達(dá)〔21〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)廣寄生能降低T2DM小鼠肝組織NF-κBp65的含量，表明廣寄生的保肝作用與降低炎癥基因表達(dá)的作用有關(guān)。PPAR-α在脂肪酸、脂蛋白代謝的過(guò)程具有調(diào)節(jié)脂代謝、糖代謝、改善胰島素抵抗的作用〔22〕。本研究發(fā)現(xiàn)廣寄生能升高T2DM小鼠肝組織PPAR-α含量，說(shuō)明廣寄生的保肝作用與增強(qiáng)PPAR-α轉(zhuǎn)錄活性，改善糖尿病代謝紊亂的作用有關(guān)。