衰老對大鼠腸道組織形態及自噬水平的影響

秦廷洋 代軍 馬曉春 趙宇艷 徐磊 張仕斌

(遵義醫學院實驗動物中心，貴州 遵義 563000)

腸道是機體吸收營養物質的主要器官，同時也是阻擋細菌、病毒等有害物質進入機體的有效屏障。衰老過程中腸道是機體起始衰老的器官之一，腸道組織退行性變、炎癥反應增加，肌層增厚，腸收縮蠕動減弱，各種消化酶水平下降，導致小腸消化吸收功能減退，經常出現慢性便秘、排便障礙等癥狀〔1〕。研究發現，自噬與多種老年病密切相關，在年老組織中，自噬相關蛋白(Atg)等自噬誘導必需的蛋白表達下調，自噬活性隨著年齡增長逐漸降低〔2〕。在正常老年大腦中，Atg5、Atg7 和Beclin1表達均下調，胰島素抵抗和代謝綜合征患者體內沉默信息調節因子(SIRT)1表達下調，而骨關節炎中靶向自噬啟動因子(ULK)1、Beclin1和微管相關蛋白1輕鏈(LC)3表達下調，表明衰老與自噬活性不足有關，進一步研究發現，活化自噬確實具有抗衰老和延長壽命的作用，在小鼠中過表達自噬小體形成過程中的關鍵蛋白 Atg5 能使小鼠壽命延長17.2%，誘導小鼠自噬活化表現出抗衰老表型，如瘦體型、胰島素敏感性增強、運動能力提高等〔3〕。目前通過自噬調節延緩機體衰老已成為廣泛學者的研究熱點，但腸道作為機體重要的組織器官，腸道組織衰老概況研究甚少，衰老過程中組織自噬水平變化尚處于未知，本試驗旨在測定衰老過程中大鼠腸道組織的形態變化及腸道組織自噬標志物LC3-Ⅱ表達情況，分析腸道組織自噬水平變化與腸道退行性變的內在聯系。

1 材料與方法

1.1 動物飼養管理 選取200～240 g雄性SD大鼠16只，自由采食，于5月齡時，采集8只大鼠腸道組織樣品作為青年組；于24月齡時，采集8只大鼠腸道組織樣品作為老齡組。

1.2 樣品采集 大鼠腹部取十二指腸、回腸、結腸中段約3 cm，用生理鹽水沖洗干凈，迅速放在4%多聚甲醛中搖勻固定24～48 h。固定好后，制作成石蠟切片，參照徐戩等〔4〕闡述的方法制作組織切片。取十二指腸、回腸、結腸中段約3 cm，將組織剪成細小的碎片，按每20 mg組織加入 150～250 μl裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃ 12 000 r/min離心 15 min，取上清，進行蛋白質定量后貯于-80℃冰箱，Western印跡測定組織LC3-Ⅱ表達量。顯微鏡拍照觀察，用Olympus攝影顯微鏡進行圖像采集，用影像分析軟件Image-Pro Plus5.02分析圖片，測定各個腸段絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度比值；Image1.8分析各組圖像灰度值。

1.3 主要試劑 LC3-Ⅱ與GAPDH抗體均由BIOSWAMP公司提供。

1.4 統計學分析 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 兩組腸道組織形態變化 老齡組十二指腸、回腸和結腸絨毛較青年組顯著萎縮變短(P<0.05)，十二指腸與結腸隱窩深度顯著縮短，回腸和結腸絨毛高度與隱窩深度比值顯著變小(均P<0.05)，老齡組腸道絨毛短小且破碎較多，整體表現為衰老，萎縮的狀態。見表1，圖1。

2.2 兩組腸道組織LC3-Ⅱ表達量 老齡組腸道組織LC3-Ⅱ表達量(0.84±0.06)較青年組(0.60±0.15)顯著升高(P<0.05)，見圖2。

表1 兩組腸道形態比較(n=8)

同行間無相同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖1 兩組腸道組織切片(×100)

1～4泳道為青年組，5～8泳道為老齡組圖2 青年大鼠與老齡大鼠腸道LC3-Ⅱ的表達量

3 討 論

腸道衰老伴隨老年性腸道疾病的發生，自噬調節是緩解機體衰老的重要途徑。老年人的消化功能及吸收功能的減退由老年人胃腸道在組織學上的退行性變導致，研究發現，衰老與腸道關系為機體衰老出現胃分泌減少，腸道菌群種類減少，腸道滲透性增強，引起腸道功能障礙及腸道慢性炎癥等的發生，嚴重情況下會演變成炎癥性疾病或使胃腸功能喪失〔5〕。老年人腸動力障礙是由腸道細胞功能紊亂所致，研究發現，Cajal間質細胞(ICC)分布于整個消化道，是胃腸道節律性活動的起搏點，在胃腸道動力的發生和動力障礙機制中具有重要作用〔6〕，ICC數量在老年大鼠消化道中顯著減少，便秘患者腸道動力障礙的重要原因是ICC數量減少和分布異常〔7〕，老年人腸道ICC功能減退可能導致腸道發生動力障礙；在大鼠生理性衰老過程中，胃腸組織中的一氧化氮合酶(NOS)隨年齡的增加而逐漸減少，氮能神經體系的衰老可能導致老年慢性便秘。自噬是廣泛存在于真核細胞中高度保守的一種溶酶體依賴性降解系統〔8〕，主要包括自噬誘導階段(由mTOR等信號轉導通路介導〔9〕)、核化階段(Vps34-Atg6/Beclin1等參與此過程〔10〕)、延伸階段(由Atg5、Atg12、Atg16 和Atg8/LC3 調控〔11〕)，自噬過程中自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，自噬溶酶體將包裹物和內膜一起降解〔12〕。自噬與多種老年病都有密切關系，包括神經退行性疾病、腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病等。研究發現，自噬小體在多種神經退行性疾病，包括阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓病及肌萎縮性側索硬化患者的大腦中堆積，提示自噬可能參與其中〔13〕。家族遺傳型PD患者中，PTEN基因誘導假定激酶(PINK)-1 和 Parkin 突變導致線粒體自噬受阻，受損線粒體和ROS大量堆積對神經元造成損傷，自噬能清除錯誤折疊及易形成聚集傾向的突變蛋白,因此活化自噬對神經退行性疾病的治療前景已得到充分證實〔13〕。自噬在腫瘤中的作用是一把“雙刃劍”，自噬能促進原癌基因誘導的老化反應,預防細胞惡性轉化；自噬抑制腫瘤轉移，對于原位的腫瘤細胞來說， 自噬通過抑制壞死及促炎免疫細胞浸潤或直接促進抗轉移免疫因子高遷移率族蛋白(HMG)B1釋放而抑制腫瘤轉移〔14〕。另一方面，自噬也能促進腫瘤的發生，自噬能維持腫瘤細胞快速增長的營養需求，活化促進腫瘤轉移，促進腫瘤細胞對化療、放療及腫瘤靶向治療產生抵抗〔15〕。自噬參與心血管疾病調節，年齡增大，心臟功能下降，在缺血階段，心肌細胞自噬的增強可為細胞提供能量，清除損傷的線粒體，抑制線粒體途徑介導的細胞凋亡，從而對心肌產生保護作用。然而細胞的自噬活性進一步增強時，過度活化的自噬可能導致心肌細胞死亡，加劇心肌細胞損傷〔16〕。自噬參與多種老年性疾病的發生，在腸道退行性變過程中，腸道組織自噬可能是調節腸道衰老的重要途徑。

自然衰老過程中大鼠腸道組織顯著萎縮，自噬流受阻可能加劇老齡大鼠腸道衰老。LC3-Ⅱ是哺乳動物細胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于自噬泡和自噬膜表面，參與自噬體的形成，是自噬小體的特異性標志分子。正常情況下，細胞內合成的LC3經過加工，成為胞質可溶性的LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ經過泛素樣加工修飾，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3-Ⅱ并聚集到自噬體膜上，其含量的多少與自噬泡數量的多少呈正比，因此可反映自噬活性〔17〕。LC3-Ⅱ本身可以通過自噬降解，LC3-Ⅱ升高除了表示自噬小體生成增多、自噬活性增強外，還可以因為自噬小體降解減少引起積聚，造成自噬活性升高的假象，因此，LC3-Ⅱ升高也可能是由于自噬流下游受阻，導致LC3-Ⅱ聚集。本研究結果提示自噬流受阻可能加劇老齡大鼠腸道退行性變，提高腸道組織自噬水平可能是緩解腸道老年性疾病的有效途徑。

腸道自噬調節可能是治療老年性腸道疾病的重要途徑。自噬是衰老過程中的重要調節機制〔18〕，隨著年齡增長，生物體細胞內損傷的大分子和細胞器逐漸堆積，錯誤折疊蛋白增多導致老年病多發，而活化自噬可以清除細胞內損傷的蛋白和細胞器，從而改善機體衰老狀態，研究還發現，自噬和凋亡性細胞死亡途徑之間可能存在復雜的相互作用，自噬與凋亡之間的相互作用也可能是自噬緩解衰老的重要原因〔19〕。總之，腸道衰老可能是造成老年性腸道疾病的主要原因，自噬在老齡大鼠腸道組織中顯著變化，自噬調節可能在大鼠腸道衰老過程中有重要作用。