葛根素對絕經后骨質疏松大鼠血清OPG、RANKL和骨組織的影響

梁倩 李海 解繼勝 黃凌凌 顧建忠 黎飚 楊潔 方曉燕

(右江民族醫學院組織學與胚胎學教研室,廣西 百色 533000)

絕經后不僅雌激素分泌較少，還會導致護骨素(OPG)水平下降，核因子-κB 受體活化因子配體(RANKL)水平升高及血清堿性磷酸酶(ALP)活性升高。這些影響骨代謝因子改變，即OPG降低，RANKL和ALP升高導致成骨功能下降破骨胞功能上升，引起骨質流失，骨皮質變薄，骨小梁變小、斷裂，稀疏變脆，易于骨折。雌激素防治絕經后骨質疏松(PMOP)效果不錯，但毒副作用令人擔憂〔1,2〕。現在人們把希望寄托在有雌激素樣作用，又無其副作用的植物性雌激素，比如：葛根和山茶籽等提取物身上。本實驗主要探討葛根素對PMOP大鼠血清OPG、RANKL及骨組織的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 5月齡SD雌性大白鼠(320～350g)96只，廣西百色榨油后的山茶籽茶麩，經脫脂后乙醇提取，并低溫濃縮為8.6 g/g的濃度，提取物保存于低溫冰箱，溫度在2～5℃，用藥的時候再把提取物稀釋至5 g/g濃度。雌二醇(E2)針劑 (每支100 μg，武漢峰耀同輝化學制品有限公司,批號：20173086)。OPG和RANKL試劑盒購于上海博湖生物科技有限公司，ALP試劑盒購于南京建成科技有限公司。

1.2 實驗大鼠分組 大鼠分成假切除卵巢(Sham)組、PMOP大鼠(OVX)組、E2治療(E2)組、山茶籽治療(Ts)組4個實驗組，每組24只，按常規籠養,標準飼料喂養,自動給水。

1.3 PMOP模型制備及給藥 除Sham組外，其余組均進行PMOP模型制備，用戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，濃度為10 g/L，劑量為3.0 mg/kg，消毒注射部位后注射麻藥，待大鼠麻醉進入可手術狀態后無菌條件下從背部雙側分別切開切口進入腹腔，分別摘除兩側卵巢，小心細針細線縫合切口。切口縫合后用75%酒精消毒，再擦上少許注射用慶大霉素液。摘除卵巢塊經過切片鏡下鑒定為卵巢。術后連續3 d用慶大霉素液涂擦手術切口，以防切口感染。造模術后7 d后用藥干預。Sham組手術方法和步驟與切除卵巢術一樣，不同的是：摘除不是卵巢，而是附在卵巢旁邊一個脂肪塊。Ts組：將原來準備好的濃度為8.6 g/g的山茶籽醇提物濃縮液用滅菌0.9%生理鹽水稀釋濃度為5 g/g的山茶籽醇提物灌胃液，用量為10 ml/(kg·d)。E2組：用E2注射液皮下注射，劑量按200 μg/kg，注射完畢，注射針口處用棉簽按壓2 min， 2次/w。Sham組：0.9%生理鹽水滅菌后進行灌胃，與Ts組等容量灌胃。

1.4 檢測指標及方法 (1)各組實驗鼠左股骨頭1 cm取材和切片觀察：盡可能剝離干凈左側股骨頭軟組織，取股骨頭近端1 cm長度。及時固定(固定液為10%甲醛)、脫鈣后按酒精梯度濃度順序進行脫水、石蠟熱熔至液態下包埋，包埋石蠟塊完成冷硬后用自動切片機進行切片，染色組織片光鏡200倍下觀察其結構并拍照保存。(2)各組OPG、ALP、RANKL測定：第2、6、 8和12 w分別取6只大鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，方法同1.3。在麻醉狀態下打開胸腔吸取左心血5 ml。4 000 r/min離心10 min獲取沉淀，取上層血清，-20℃保存待測。按試劑盒說明測定OPG、ALP及RANKL。

1.5 統計學分析 應用SSPS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 各組股骨頭鏡下組織結構比較 Sham組股骨頭周圍骨皮質厚而致密，骨髓腔大小適中，骨皮質小粱大小、粗細、排列規律正常，骨細胞大小正常，位于骨陷窩內,骨細胞與骨陷窩壁鑲貼緊密,沒有空洞。OVX組股骨頭周圍骨皮質變薄，股骨頭的骨皮質小梁變小變短，骨小梁與骨小梁之間間隙明顯比其他3組增大。骨細胞萎縮變小，骨細胞與骨陷窩壁間隙明顯增大，呈明顯骨質疏松表現；與OVX組比較，E2組和Ts組股骨頭周邊骨皮質較厚和骨小梁較均勻密度排列，小梁之間間隙變小，骨細胞大小正常，骨細胞與骨陷窩之間沒有明顯腔隙。疏松病理現象改善明顯。E2組和Ts組鏡下骨組織切片形態結構相近。見圖1。

2.2 各組ALP含量比較 OVX組2、6、8、12 w ALP含量均顯著高于其他3組(P<0.01)；Sham組、E2組、Ts組ALP含量差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同時間各組ALP含量比較

與OVX組比較：1)P<0.01；下表同

2.3 各組OPG含量比較 OVX組2、6、8、12 w OPG水平明顯低于其他3組(P<0.01)；Sham組、E2組、Ts組第2、6、8、12 w OPG水平無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 不同時間各組OPG水平比較

2.4 各組RANKL水平比較 OVX組2、6、8、12 w RANKL水平明顯高于同時期其他3組(P<0.01)；Sham組、Ts組、E2組第2、6、8、12 w RANKL水平無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 不同時間各組RANKL水平比較

3 討 論

OVX組大鼠血清OPG降低，RANKL和ALP升高，且骨切片光鏡可見，骨細胞萎縮變小，骨細胞與骨陷窩壁間隙明顯增大，骨質疏松的典型表現，說明模型制備成功。

通過摘除SD雌性大鼠卵巢，使其雌激素減少來源，明顯降低雌激素血液水平，很好模擬絕經后老年女性卵巢功能退化導致雌激素減少引起骨質疏松。通過E2干預后，大鼠股骨頭骨小梁變粗變密，骨小梁與骨小梁之間間隙明顯變小變窄，骨細胞與骨陷窩壁間隙明顯縮小。骨質疏松的病理改變得到明顯好轉。通過E2干預后，大鼠血清OPG明顯提高，而RANKL和ALP明顯降低。因為雌激素有促進OPG分泌，促使成骨細胞提高成骨功能〔3〕，抑制RANKL生成，降低ALP水平，從而抑制破骨細胞的溶骨作用〔4～7〕。Ts組也有E2組相似作用，也能提高OPG，降低RANKL和ALP,說明也有雌激素樣作用，也有提高成骨細胞形成骨質、促進骨質形成、鈣化作用，抑制破骨細胞作用〔8～11〕，可以用于PMOP治療。

本研究結果表明，葛根素可以提高OPG，增加骨量，降低RANKL和ALP，拮抗破骨細胞功能，從而達到防治雌激素減少導致的骨質疏松，與相關研究結果一致〔12～15〕。