固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定茶產(chǎn)品中吡蚜酮

余煥，周利，林琴，楊潔，孫荷芝，伍旭東，王新茹，張新忠，陳宗懋，羅逢健

固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定茶產(chǎn)品中吡蚜酮

余煥1,2，周利1*，林琴1,2，楊潔1,2，孫荷芝1，伍旭東3，王新茹1，張新忠1，陳宗懋1，羅逢健1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究中心，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3. 普洱市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 普洱 665099

建立了Cleanert PCX固相萃取，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定干茶、抹茶和速溶茶粉中吡蚜酮?dú)埩袅康姆治龇椒ā８刹琛⒛ú韬退偃懿璺壑械倪裂镣?jīng)甲醇和水的混合溶液提取、Cleanert PCX固相萃取柱富集凈化和Acquity BEH C18色譜柱分離后，通過UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）測定，外標(biāo)法定量。在0.005~1.000?mg·kg-1添加范圍內(nèi)，吡蚜酮的平均回收率為77.0%~95.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=5）為1.8%~6.9%，方法的定量限（LOQ）為0.005~0.010?mg·kg-1。該方法在靈敏度、準(zhǔn)確度和回收率上均符合農(nóng)藥殘留檢測的要求，可為茶產(chǎn)品中吡蚜酮?dú)埩袅康臏y定和風(fēng)險(xiǎn)評估提供分析方法。

吡蚜酮；茶；農(nóng)藥殘留；固相萃取法；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

茶葉是世界公認(rèn)的健康飲品。我國是世界上茶葉種植面積和產(chǎn)量最大的國家，茶葉出口量占世界第二位。農(nóng)藥殘留是影響茶葉及其加工產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素，分析方法是保障質(zhì)量安全的必要手段。吡蚜酮（Pymetrozine，CAS 123312-89-0）屬吡啶類殺蟲劑，對小貫小綠葉蟬、茶綠盲蝽等害蟲的防效優(yōu)良，其使用會在一定程度上造成初級茶產(chǎn)品和茶葉加工產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留。歐盟和我國制定的茶葉中吡蚜酮的最大殘留限量分別為0.1?mg·kg-1和2?mg·kg-1。吡蚜酮一直被認(rèn)為是農(nóng)殘測定中的“問題農(nóng)藥”[1-6]，在多項(xiàng)多殘留方法報(bào)道中其回收率達(dá)不到農(nóng)殘檢測的要求，尤其在柑橘等酸性基質(zhì)樣品中[1,5]。吡蚜酮在水果、蔬菜、煙草等農(nóng)作物中的提取凈化方法主要包括液液分配方法（LLE）[7]和固相萃取方法（SPE）[8]，但是LLE方法操作繁瑣，二氯甲烷等有機(jī)溶劑毒性較高且用量大。SPE方法具有較高的回收率和靈敏度，氨基柱、C18柱、HLB固相萃取柱已應(yīng)用于芹菜[9]、煙草[10]、菠菜[11]、棉籽[12]等基質(zhì)中吡蚜酮?dú)埩袅康臏y定，定量限（LOQ）在0.001~0.017?mg·kg-1。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法也應(yīng)用于番茄[13]、水稻和環(huán)境樣品[14]中吡蚜酮?dú)埩袅康臏y定，但該方法應(yīng)用于速溶茶粉中的吡蚜酮測定時(shí)，回收率僅60%[15]。對于茶葉中吡蚜酮檢測方法的研究較少，張?zhí)锾锏萚16]采用SCX固相萃取柱測定了田間樣品干茶和鮮葉中吡蚜酮的殘留量，而對抹茶和速溶茶粉等茶產(chǎn)品中吡蚜酮的測定方法未見報(bào)道。

本研究優(yōu)化了干茶、抹茶和速溶茶粉等茶產(chǎn)品中吡蚜酮?dú)埩袅繙y定的前處理?xiàng)l件，建立了甲醇和水混合提取，PCX固相萃取凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測定吡蚜酮?dú)埩袅康姆治龇椒ǎ蓾M足茶葉和茶產(chǎn)品中吡蚜酮?dú)埩袅康臏y定要求。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC/Quattra Premier XE超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，ESI源，Mass Lynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件（美國Waters公司）；高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司）；純凈水（杭州娃哈哈有限公司）；甲酸（≥98.0%，CNW Technologies Gmb H）；氨水（25%~28%，分析純，上海試四赫維化工有限公司）；鹽酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)）；吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%，CNW Technologies Gmb H）；Cleanert PCX混合陽離子交換固相萃取柱（60?mg/3?mL，天津博納艾杰爾科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)品0.050?0?g（精確至0.000?1?g）于50?mL容量瓶中，乙腈定容，配制成1?000?mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于–20℃保存。乙腈逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液配置所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于–20℃保存。

1.2.2 樣品提取

干茶和抹茶：稱取1.0?g粉碎成茶樣品或抹茶樣品于50?mL帶蓋離心管中，加入4?mL水，混勻靜置10?min，加入16?mL甲醇，渦旋1?min，靜置30?min。7?000?r·min-1離心5?min后取10?mL上清液于40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，吹干后加入10?mmol·L-1鹽酸水溶液10?mL溶解殘?jiān)齼艋Ｋ偃懿璺郏喝?.1?g茶粉樣品于50?mL帶蓋離心管中，加入20?mL去離子水，混勻渦旋1?min后，加入1?mol·L-1鹽酸水溶液200?μL混勻，待凈化。

1.2.3 樣品凈化

Cleanert PCX固相萃取柱經(jīng)5?mL甲醇和5?mL水活化后，上樣全部待凈化液，棄去全部流出液。用5?mL 2%甲酸水溶液和5?mL甲醇溶液依次淋洗PCX柱，棄去淋洗液。用3?mL 1%氨水甲醇溶液上柱洗脫，用空氣泵抽干固相萃取柱填料層中的溶液，收集全部洗脫液于雞心瓶，40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，吹干后以1?mL甲醇水溶液（甲醇∶水=8∶2）定容，過0.22?μm濾膜，待UPLC-MS/MS測定。

1.2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

分別稱取空白干茶1.0?g，抹茶1.0?g，茶粉0.1?g于50?mL離心管中，添加不同濃度水平的吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.2章節(jié)和1.2.3章節(jié)進(jìn)行樣品提取和樣品凈化步驟。同樣處理不添加農(nóng)藥的空白干茶、抹茶和茶粉，作為基質(zhì)空白溶液，用于配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.5 液相色譜條件

ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1?mm×100?mm，1.7?μm）。流動相組成：流動相A為1‰甲酸乙腈，流動相B為純凈水。流動相洗脫程序：0~0.5?min，5% A；0.5~3.0?min，5%~30% A；3.0~4.0?min，30%~70% A；4.0~4.8?min，70%~99% A；4.8~5.8?min，99% A；5.8~7.3?min，99%~5% A。進(jìn)樣體積設(shè)置為5?μL；流速設(shè)置為0.25?mL·min-1；色譜柱柱溫40℃。吡蚜酮保留時(shí)間2.54?min。

1.2.6 質(zhì)譜條件

電離方式ESI+，多級反應(yīng)監(jiān)測MRM模式，毛細(xì)管電壓3.5?kV，離子源溫度150℃，去溶劑化溫度350℃。錐孔反吹氣N2氣，流量50?L·h-1；脫溶劑氣N2氣，流量650?L·h-1。碰撞氣Ar氣，流量0.35?mL·min-1；倍增電壓650?V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

全掃描方式進(jìn)樣吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得吡蚜酮特征離子，選擇離子豐度最高的[M+H]+ m/z 218.1作為母離子，優(yōu)化獲得母離子最高響應(yīng)時(shí)的錐孔電壓為30?V。逐級增加碰撞能量，獲得離子豐度最高的特征子離子m/z 105.1和79.1，最優(yōu)碰撞能量分別為15?V和25?V，且m/z 218.1>105.1和218.1>79.0處無基質(zhì)干擾，因此選擇響應(yīng)最高的m/z 218.1>105.1作為定量離子對，m/z 218.1>79.0作為定性離子對。

2.2 提取過程的優(yōu)化

2.2.1 干茶和抹茶中吡蚜酮提取方法的確定

分別以甲醇、乙腈和丙酮3種有機(jī)溶劑和水的混合溶液（有機(jī)溶劑∶水=8∶2）作為提取溶劑，丙酮提取液顏色呈黑褐色，在后續(xù)凈化過程中，PCX固相萃取柱堵塞嚴(yán)重。多項(xiàng)研究表明，中性和酸性乙腈作為水果和蔬菜中吡蚜酮的提取溶劑，其提取效率低于50%[17]；本試驗(yàn)中乙腈作為干茶中吡蚜酮的提取溶劑，平均回收率在60%左右。甲醇和水作為提取溶劑，吡蚜酮的平均回收率高于80%，該結(jié)果與蜂蜜中吡蚜酮的研究結(jié)果相似[18]。因此確定干茶和抹茶提取過程中的有機(jī)試劑組成為甲醇。

提取溶劑中甲醇體積分?jǐn)?shù)對回收率的影響如圖1所示。采用純甲醇作為提取溶劑，干茶中吡蚜酮的提取效率僅在60%左右；在提取溶劑中加入一定量的水，逐漸降低提取溶劑中甲醇的比例至80%，吡蚜酮的平均回收率升高至95.9%；繼續(xù)降低甲醇體積分?jǐn)?shù)，吡蚜酮回收率降低。研究表明，對于干茶樣品中水溶解度較高的殘留農(nóng)藥，常通過在提取溶劑中加入一定比例的水來提高該類農(nóng)藥的回收率[19]。吡蚜酮屬較高水溶解度的農(nóng)藥（水溶解度為0.29?g·L-1），具有內(nèi)吸性，易滲透進(jìn)入植物組織，因此水的加入可提高干茶中吡蚜酮的提取效率。但是吡蚜酮在醇類中的溶解度遠(yuǎn)高于在水中的溶解度，因此過多的水含量不利于吡蚜酮在干茶中的提取。抹茶與干茶加工工藝不同，抹茶是以遮陰栽培的茶鮮葉為原料加工成干茶，再經(jīng)研磨處理成的超微細(xì)粉。對比試驗(yàn)表明，提取溶劑中甲醇比例低于80%后，抹茶中吡蚜酮的回收率變化不大；但是60%甲醇條件下，由于提取后溶液中含有較高含量的水分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程耗時(shí)較長。綜合考慮吡蚜酮的回收率和試驗(yàn)操作的時(shí)長，選擇干茶及類似樣品（如抹茶）中吡蚜酮的提取溶劑為甲醇和水的混合溶液（甲醇∶水=8∶2）。

提取溶劑體積對吡蚜酮回收率的影響表明，當(dāng)提取溶劑體積為10?mL時(shí)，干茶中吡蚜酮的回收率達(dá)83.7%；抹茶中吡蚜酮的回收率隨著提取溶劑體積的增加而增加（圖2），提取體積大于15?mL時(shí)，吡蚜酮回收率大于80%；提取溶劑體積高于20?mL時(shí)，提取效率幾乎不再增加。由顯著性差異分析可知，提取溶劑體積為15?mL，20?mL和25?mL時(shí)，抹茶中吡蚜酮的添加回收率無顯著性差異（>0.05）。為確保干茶和抹茶中吡蚜酮提取效率，選擇干茶和抹茶中吡蚜酮提取溶劑的體積為20?mL。

圖1 提取溶劑中甲醇體積分?jǐn)?shù)對吡蚜酮提取效率的影響（n=3）

2.2.2 速溶茶粉中吡蚜酮提取方法的確定

速溶茶粉是一種方便快捷的茶葉消費(fèi)產(chǎn)品，其制作方法多采用熱水浸提，真空濃縮再噴霧干燥的方法獲得。以干茶和抹茶中吡蚜酮提取方式提取速溶茶粉中的吡蚜酮，回收率低，因此甲醇和水的混合溶液不適合作為速溶茶粉基質(zhì)的提取溶劑。根據(jù)速溶茶粉的工藝特征，以及速溶茶粉在一定條件下可完全溶解于水的特點(diǎn)，考察了水作為提取溶劑對速溶茶粉中吡蚜酮提取回收率的影響。結(jié)果表明，以20?mL水溶解并提取0.10?g茶粉中的吡蚜酮，平均回收率在90%，因此確定以水作為速溶茶粉中吡蚜酮的提取溶劑。

圖2 提取溶劑體積對抹茶中吡蚜酮提取效率的影響（n=3）

Fig.2Effect of extract solvent volume on extraction efficiency of pymetrozine in matcha(n=3)

2.3 凈化過程的優(yōu)化

2.3.1 上樣溶劑的選擇

試驗(yàn)所用PCX固相萃取柱是以水可浸潤型聚合物為基質(zhì)的混合型弱陽離子交換固相萃取柱，保留機(jī)理為陽離子交換和反相保留機(jī)理，對堿性化合物有很好的保留特性[20]。分別以10?mmol·L-1鹽酸水溶液、2%甲酸水溶液和2%乙酸水溶液溶解干茶和抹茶提取后的殘?jiān)砑踊厥章式Y(jié)果表明（圖3），10?mmol·L-1鹽酸水溶液的添加回收率高于甲酸水和乙酸水溶液的對應(yīng)處理。這可能是因?yàn)樵谒嵝詶l件下吡蚜酮解離形成帶正電的離子，凈化過程中吡蚜酮通過正負(fù)電荷的相互作用吸附在陽離子交換柱上，而鹽酸作為無機(jī)酸，使得吡蚜酮在水中的解離程度高于有機(jī)酸甲酸和乙酸，因此目標(biāo)化合物吡蚜酮的陽離子化程度較高，在固相萃取柱中的吸附作用最強(qiáng)，所以選擇使用10?mmol·L-1鹽酸水溶液溶解殘?jiān)鳛榇齼艋骸?/p>

2.3.2 洗脫溶劑的優(yōu)化

試驗(yàn)中優(yōu)化了1%氨水甲醇洗脫溶液的體積，分別采用3、5、7、9?mL 1%氨水甲醇溶液作為洗脫溶液，干茶中吡蚜酮的平均回收率如圖4所示。洗脫溶劑體積為3?mL時(shí)，吡蚜酮的平均回收率高于80%；洗脫溶劑體積高于5?mL時(shí)，吡蚜酮的回收率稍有下降，可能是因?yàn)楣蚕疵撾s質(zhì)的增加影響了質(zhì)譜響應(yīng)。基于添加回收率要求和試驗(yàn)操作的實(shí)際需求，選擇3?mL 1%氨水甲醇溶液作為洗脫液。

圖3 上樣溶劑中酸調(diào)節(jié)劑種類對干茶中吡蚜酮提取效率的影響（n=3）

2.4 方法確證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)

電噴霧離子化效率易受樣品基質(zhì)的影響，色譜分離時(shí)共流出物質(zhì)會影響待測成分的離子化效率，從而引起質(zhì)譜信號的改變。質(zhì)譜信號的增強(qiáng)或抑制作用通常以基質(zhì)效應(yīng)表示（ME）：ME%=100×(i/0－1)，i為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，0為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME＜0時(shí)，則呈現(xiàn)基質(zhì)減弱效應(yīng)；當(dāng)ME＞0時(shí)，則呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。在最優(yōu)的提取、凈化和測定條件下，分別用純?nèi)軇⒏刹琛⒛ú韬退偃懿璺劭瞻谆|(zhì)準(zhǔn)確配制含量為0.001~1.000?mg·L-1的吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，以5~8點(diǎn)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。吡蚜酮溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為=8?809?380+26?002，相關(guān)系數(shù)（2）為0.999?6；吡蚜酮在干茶、抹茶和速溶茶粉基質(zhì)中的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1）2為0.998?6~0.999?7。計(jì)算可知，吡蚜酮在干茶、抹茶和速溶茶粉基質(zhì)中的ME在–11.62%~–34.05%，即吡蚜酮在3種基質(zhì)中均存在一定的基質(zhì)抑制效應(yīng)。為了提高方法的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正方法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償。

圖4 洗脫溶劑體積對干茶中的吡蚜酮提取效率的影響（n=3）

Fig.4Effect of elution volumes on recovery of pymetrozine in dry tea(n=3)

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度、精密度和定量限

在最優(yōu)條件下，對吡蚜酮在3種基質(zhì)中的添加回收率進(jìn)行考察。如表1所示，在0.005~ 1.000?mg·kg-1的添加濃度下（n=5），吡蚜酮的添加回收率在77.04%~95.14%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.85%~6.91%，回收率和精密度數(shù)據(jù)均符合農(nóng)藥殘留檢測要求。以最小添加濃度作為方法的定量限LOQ，則吡蚜酮在干茶、抹茶和速溶茶粉中的LOQ分別為0.005、0.005mg·kg-1和0.010mg·kg-1。茶產(chǎn)品空白樣品、添加樣品和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中吡蚜酮的色譜圖如圖5所示。

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本文所建立的方法，對12份不同市場來源的茶葉、抹茶、速溶茶粉和1份田間藥后的茶葉樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明，市場樣品中均未檢出吡蚜酮，田間茶葉樣品中吡蚜酮的殘留量為0.056?mg·kg-1（圖5-A4）。

表1 方法確證參數(shù)

注：空白樣品：干茶A1，抹茶B1，速溶茶粉C1；基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)：A2 0.002?5?mg·L-1，B2 0.002?5?mg·L-1，C2 0.001?mg·L-1；添加樣品：A3 0.005?mg·kg-1，B3 0.005?mg·kg-1，C3 0.01?mg·kg-1；干茶實(shí)際樣品：A4

3 結(jié)論

本文利用甲醇和水混合提取、PCX固相萃取柱凈化、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定，建立了干茶、抹茶和速溶茶粉中吡蚜酮?dú)埩袅康臏y定方法，該方法簡便快速、靈敏度高、有機(jī)溶劑用量少，在回收率、定量限和精密度等方面均能滿足我國和其他茶葉進(jìn)口國家或地區(qū)對茶葉中吡蚜酮檢測的殘留限量要求。

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Determination of Pymetrozine in Tea Products by Solid Phase Extraction-Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YU Huan1,2, ZHOU Li1*, LIN Qin1,2, YANG Jie1,2, SUN Hezhi1, WU Xudong3, WANG Xinru1, ZHANG Xinzhong1, CHEN Zongmao1, LUO Fengjian1*

1. Research Center of Quality Safety for Agricultural Products, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008,China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3. Pu'er Comprehensive Technical Testing Center, Pu'er 665099, China

An analytical method for the determination of pymetrozine residues in tea products, including dry tea, matcha and instant tea powder, was established based on Cleanert PCX solid phase extraction-ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The residual pymetrozine in dry tea, matcha and instant tea powder was extracted by a mixture of methanol and water, cleaned up and concentrated by a Cleanert PCX SPE column, and separated on an Acquity BEH C18column. Pymetrozine level was detected by UPLC-MS/MS on multiple reaction monitoring (MRM) mode and quantified with external standard method. In the spiked range of 0.005-1.000?mg·kg-1,the average recovery of pymetrozine was 77.0%-95.1%, and the relative standard deviation (RSD, n=5) ranged from 1.8%-6.9%. The limit of quantitation (LOQ) was 0.005 to 0.010?mg·kg-1. The sensitivity, precision and recovery of the developed method meet the requirements for residual pesticides analysis in various tea products. The results of this study can provide an analytical method for the determination and risk assessment of pymetrozine in tea products.

pymetrozine, tea, pesticide residue, solid phase extraction, UPLC-MS/MS

S571.1；S482

A

1000-369X(2019)04-440-07

2018-12-13

2019-02-15

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0200207）、浙江省自然科學(xué)基金（LY18C160005）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-TRICAAS）

余煥，女，碩士研究生，主要從事農(nóng)藥殘留方面的研究，yhteawork@163.com。*通信作者：lizhou@tricaas.com，lfj@tricaas.com