山東銀蓮花葉片形態結構對異質生境和海拔變化的響應

于文英,高 燕,逄玉娟,王 鷙,卞?；?*

1 煙臺大學光電信息科學技術學院, 煙臺 264005 2 煙臺市昆崳山林場, 煙臺 264112 3 煙臺大學生命科學學院, 煙臺 264005

全球變暖和日益增加的水資源短缺是農林業可持續發展面臨的兩個重大問題,植物如何適應復雜多變的自然環境一直是植物學家們致力研究的核心與重點[1]。生物適應環境同時影響環境,二者相互影響、相互依賴、相輔相成,在漫長的進化過程中,逐步形成了各種有效適應環境的機制。研究植物對環境的適應策略對其保護、栽培和引種等都具有重要的實際應用價值。

山東銀蓮花(Anemoneshikokiana(Makino) Makino)是膠東半島和日本四國島特有、狹域、間斷分布的極小種群。在中國間斷分布于山東昆崳山和嶗山,包含兩個典型的異質環境：如昆崳山海拔650—800 m濕潤、陰暗的針闊混交次生林和海拔800 m以上干旱、強光照的山頂灌叢[2]。異質的生境中細胞學水平、DNA水平和蛋白質水平具有較高的多樣性[3- 5],表明該物種對兩種差異明顯的生境表現出極強的適應性。山東銀蓮花僅有地下根狀莖,無地上莖,只有基生葉,葉片是植物進行光合作用以及與外界環境進行物質、能量交換的主要器官,因此葉片是該種響應異質生境的最佳部位,研究葉片的外部形態及其內部解剖結構的變化對揭示其適應策略具有重要意義,為將來研究其適應機制提供基礎。

本研究通過對不同海拔、不同生境中山東銀蓮花葉片外部形態和內部結構特征的研究,揭示該種植物對不同海拔和異質生境的響應機制,為將來分子水平上揭示其適應機制打下基礎,以達到更好的保護和利用之目的。

1 取樣地點與策略

昆崳山位于山東省東部的膠東半島,屬于暖溫帶季風氣候,兼有海洋性氣候,四季分明,季風顯著,雨量充沛,空氣濕潤,光照充足。年平均氣溫11—12℃,年降雨量800—1000 mm,主要集中在6—9月,全年無霜期200 d左右,最高海拔為923 m,植被類型為暖溫帶落葉闊葉林。

山東銀蓮花在昆崳山多見于680 m以上針闊混交林下和山頂灌叢,自700 m開始,海拔梯度每垂直升高50 m設置一條樣帶,共5個樣帶：700、760、800、850、900 m,前3個代表林下生境,后兩個代表山頂生境。每條樣帶內平行隨機選取多年生植株3—5棵,每棵采集一片相同位置、成熟、沒有明顯病菌癥狀或者動物咬噬的葉片,編號、裝入自封袋,當天帶回實驗室,冰箱冷藏保存備用。同時選擇每棵植株上另一片相同位置的葉片,自中部剪取2—3個1 cm×1 cm小塊,直接放入FAA固定液中固定保存,用于石蠟包埋切片和葉片上、下表皮及氣孔觀察。

2 研究方法

2.1 山東銀蓮花葉片形態學研究

2.1.1 葉片表面附屬結構的差異

用leica體視顯微鏡系統觀察不同生境內不同海拔山東銀蓮花葉片背、腹兩面的附屬結構,自葉緣至葉片中部隨機選擇3個區域,每個區域觀察3個視野,拍照并用系統自帶軟件統計其長短、大小、密度等。

2.1.2 葉片形態的差異

掃描儀掃描葉片,同時加標尺作為葉片長寬參照,保存圖像。利用ImageJ圖像處理軟件測定葉片的長、寬和面積。最后將葉片放入65℃烘箱直至恒重,用萬分位的電子天平稱其干重,計算比葉面積,比葉面積=葉面積/葉干重。

2.2 山東銀蓮花葉片解剖結構的研究

2.2.1 氣孔及表皮細胞的差異

取FAA中固定的葉片小塊,用清水沖洗后,放入10%的次氯酸鈉溶液中浸泡至葉片發白,取出并用蒸餾水清洗,采用離析刮制法制取葉片上、下表皮,進行酒精梯度脫水、二甲苯透明、染色,制成臨時裝片,顯微鏡觀察、拍照。

隨機選擇3個視野,分別統計上、下表皮氣孔數量和表皮細胞數量,用顯微系統自帶軟件計算上、下表皮的氣孔密度(個/mm2)、表皮細胞密度(個/mm2)；計算氣孔指數,氣孔指數=100×氣孔密度/(氣孔密度+表皮細胞密度)；每個視野隨機選擇3個氣孔放大拍照,顯微鏡自帶測量系統,同時目鏡測微尺輔助測其長、寬,計算相對開度,氣孔相對開度=氣孔寬/氣孔長。

2.2.2 葉肉組織的差異

常規石蠟包埋組織切片,顯微鏡觀察,隨機選擇3個視野拍照。顯微鏡自帶測量系統,同時目鏡測微尺輔助測量葉片厚度、上下表皮厚度、柵欄組織和海綿組織厚度,每項每個視野測量三次。

2.3 數據統計分析方法

所有數據用Excel記錄整理,并計算平均數及標準差,SPSS 17.0軟件進行統計分析和差異顯著性檢驗(P<0.05)。

3 結果與分析

3.1 葉片表面附屬結構

利用體視鏡觀察發現,山東銀蓮花葉片背面的表皮毛分布均勻,纖細、不分枝；葉片腹面的表皮毛短、硬,分布不均勻,主要密集于葉脈,尤其是較大的葉脈內側,朝向于一個方向,非葉脈處毛稀疏、細且短。

圖1是5個海拔梯度樣帶內山東銀蓮花背、腹兩面表皮毛長短和密度的比較。由圖可知,葉片背面毛的長度長于葉片的腹面,與海拔差異無關。腹面毛長度隨海拔升高而略微縮短,700 m處表皮毛明顯最長；背面毛的長度與海拔沒有明顯的關系。腹面表皮毛密度850 m以上表現出增加的趨勢；背面表皮毛密度在800 m以下逐漸增加,850 m下降并趨于平穩。

700—800 m林下和850—900 m山頂兩種不同生境中,葉片背面毛的長度總是長于葉片的腹面,林下(700、760、800 m)葉片腹面表皮毛比山頂(850、900 m)腹面表皮毛長；林下葉片表皮毛的密度背、腹兩面都略大于山頂的密度,表明生境對表皮毛的影響大于海拔對它的影響。

圖1 不同海拔山東銀蓮花葉片表皮毛長度和密度的比較Fig.1 Comparison of length and density of epidermal hairs in leaf blade of A. shikokiana from different elevation gradients

3.2 葉干重和比葉面積

從圖2可以看出,葉長、寬、面積對不同生境和海拔變化不敏感,未表現出明顯的差異,山頂(850、900 m)葉面積與林下(700、760、800 m)葉面積大小差異不大,葉干重760 m以上隨海拔升高而增加,山頂葉干重明顯高于林下,比葉面積山頂明顯低于林下,并且差異性顯著(P<0.05)。

圖2 不同海拔山東銀蓮花葉片形態比較Fig.2 Comparison of leaf morphology of A. shikokiana from different elevation gradients

3.3 表皮氣孔

顯微觀察發現,上、下表皮細胞形狀不規則、排列緊密、彼此嵌合。5個海拔梯度內的葉片上表皮均沒有氣孔,下表皮具有無規則型的氣孔,同一生境不同海拔的葉片氣孔排列差別不明顯,山頂較林下氣孔排列緊密整齊(圖3)。

圖3 山東銀蓮花葉表皮比較Fig.3 Comparison of leaf epidermisesa. 混交林上表皮; b. 混交林下表皮; c. 灌從上表皮; d. 灌從上表皮

圖4是5個海拔梯度樣帶內山東銀蓮花氣孔密度、氣孔相對開度和氣孔指數的比較。氣孔相對開度與海拔負相關,隨海拔升高而減小,差異性顯著(P<0.05)；而氣孔密度和氣孔指數與海拔沒有明顯的相關性,差異性不顯著(P>0.05)。山頂與林下相比較,氣孔密度和氣孔指數有升高的趨勢,表明山東銀蓮花氣孔對生境比對海拔的變化更敏感。

圖4 不同海拔山東銀蓮花葉片氣孔的比較Fig.4 Comparison of leaf stomata of A. shikokiana from different elevation gradients

3.4 葉片厚度

林下柵欄組織細胞排列不整齊、疏松,山頂柵欄組織仍是一層細胞,但是排列更加緊密、整齊,較林下更厚,海綿組織山頂較林下更加發達(圖5),同一生境內不同海拔梯度的葉肉細胞差異不明顯。

圖6是5種海拔梯度樣帶內山東銀蓮花葉片厚度、上下表皮厚度、柵欄組織和海綿組織厚度的比較。海拔變化對各單因素參數引起的差異不顯著(P>0.05),山頂與林下比較,葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度均增加,差異顯著；上下表皮厚度沒有明顯差異(P>0.05),表明表皮細胞對海拔變化和生境變化不敏感。山頂葉片加厚的主要因素在于葉肉組織的改變,尤其是海綿組織厚度的增加從而增加了葉片的厚度。

圖6 不同海拔山東銀蓮花葉片厚度的比較Fig.6 Comparison of the leaf thickness in A. shikokiana from different elevation gradients

4 討論

4.1 山東銀蓮花對異質生境的響應

植物適應環境的選擇壓力是非常復雜的過程,為了適應環境,必須調整自身的相應機制,啟動相關的信號系統滿足需要。葉片是植物暴露在空氣中進行同化作用的主要器官,其組織結構對周圍環境反應敏銳,其形態結構在外界生態因素的長期作用下具有很大的變異性和可塑性,與植物生長對策及利用資源的能力緊密相關[6]。針闊混交林下水分充足、營養豐富,但是缺少光照,山頂灌叢光照充足,但是水分虧缺。山東銀蓮花為了適應兩種不同的生活環境,葉片形態和內部解剖結構表現出明顯的差異,以獲取最大利益滿足自身需求。

(1)比葉面積 比葉面積與植物相對生長速率、光合速率、葉氮含量有關,可用來反映植物的碳獲取策略,是生理過程權衡的最佳指標[7]。比葉面積較大的植物葉片資源捕獲面積大,具有較高的凈光合速率,一般光照越弱、葉片越薄、單位面積的干重越小,比葉面積則越大。本研究混交林下的山東銀蓮花接受較弱的光照,具有明顯大于山頂的比葉面積,符合植物葉片適應弱光照的一般規律。比葉面積較低的植物將更多的物質用于構建保衛構造或者增加葉肉細胞密度,可以有效的減小蒸騰和防止葉片過度失水[8],更好的適應資源貧瘠和干旱的環境。山頂山東銀蓮花具有較低的比葉面積,一定程度上可以保持葉片水分,增強抗旱能力。

(2)葉片厚度 山頂的山東銀蓮花葉片增厚,尤其是柵欄組織的增厚能夠減少水分的散失；林下山東銀蓮花具有較薄的葉片以縮短光線到達葉綠體的距離,使其最大量地吸收微弱的光線滿足光合作用之所需。干旱條件下黃瓜葉片因柵欄組織和海綿組織厚度的減小使其總厚度減小[9],與本研究結果不一致。葉片厚度與資源獲取、水分保存和同化有關,較厚的柵欄組織增加葉片內部水分向葉片表面擴散的距離和對水流的阻力,減小水的蒸騰,提高水的利用效率,更好的適應干旱脅迫[10-11],這是對本研究山頂葉片厚度增加最好的解釋。

(3)氣孔 氣孔是植物適應水分、光照的主要限制因子之一,是植物氣體交換的微型閥門,控制著空氣和水分的進出,旱生植物的氣孔有助于植物在缺水時保持較高的光合速率[12- 14],表現在氣孔大小、密度、開度等方面。山頂植株氣孔密度增加,但是減小了氣孔大小甚至關閉從而減少過度蒸騰,與LIU等的研究結果一致[9]。林下的山東銀蓮花為了更加順暢的進行氣體交換,滿足光合作用需要,并排出多余的水分,具有較大的氣孔相對開度以適應林下的環境。

雖然山東銀蓮花葉片的多數特征表現出與生境的高度適應,但是,某些特征卻表現出與環境條件不匹配的“非適應性”。

(1)表皮毛 林下植株為充分接受微弱的光照一般具有較短的表皮毛和較低的密度,山頂為減少蒸騰多具有較長的表皮毛和較高的表皮毛密度,而實驗結果卻相反?？赡艿脑蚴侨~片背光面表皮毛對光照的影響不大,主要作用可能只是避免害蟲咬噬起保護作用；上表皮雖然接受陽光照射,但是表皮毛主要密集于葉脈內側,而且短、硬、沿葉脈方向傾倒,不影響葉肉細胞接受光照。

(2)氣孔密度 山頂為保持水分多具有較低的氣孔密度,而本研究山頂氣孔密度較大,但是氣孔相對開度較低、光照較強的時間段多數關閉以減少水分的散失。有研究表明氣孔孔徑大小隨氣壓和溫度的升高而下降[15],本研究氣孔開度是否也受氣壓和溫度影響,有待進一步研究。而且植物葉片氣孔密度越大,有利于短時間內充分利用有效水分進行光合作用[16]。多數植物在中度干旱脅迫下,氣孔密度增加,而在重度干旱脅迫下,氣孔密度減少[17-18],因此可能山頂只是處于中度干旱脅迫。Zhao等認為水分虧缺刺激了氣孔生成,導致氣孔密度增加[19]。但Sam等認為干旱脅迫下植物較高的氣孔密度與葉面積減小有關[20]。此外,楊惠敏和王根軒的研究結果發現干旱條件下,植物氣孔減小,密度增大,分布趨向均勻,在保持光合的同時減小水分的散失[21],與本實驗結果一致。由此看出,各種植物適應環境的特征和機制有共性也有其各自的特性,結果不具有普適性。

4.2 山東銀蓮花對海拔變化的響應

海拔梯度包含了溫度、濕度、光照和土壤等諸多環境因子的劇烈變化,氣溫、氣壓、CO2濃度等環境因子隨海拔升高而降低,而光照強度則隨海拔升高而增加[22]。近年來,通過海拔梯度上植物葉片性狀與環境因子相互關系來研究環境變化,已成為研究全球氣候變化的熱點之一[23-24]。

本研究只有葉片腹面表皮毛的長度和氣孔相對開度與海拔梯度表現出負相關性,隨海拔升高而逐漸減小,更好地滿足其生活需要。其余葉片特征如柵欄組織和海綿組織厚度、氣孔密度、比葉面積等對海拔變化均未表現出明顯的規律性,即對海拔變化不敏感。可能的原因在于本研究由于兩個生境海拔相差不大,每個生境再分成不同的海拔梯度,可能對結果無明顯影響。

某些單一葉片特征與海拔不具有明顯的相關性,但是將兩個或多個特征因素綜合考慮,可以看出它們存在協同關系。如比葉面積與氣孔密度,二者對海拔變化均未表現出規律性變化,但是二者之間具有彼此消長的關系,以此適應不同環境。Romero-Munar等也發現葉片可塑性和氣孔調節相互協調、相互配合共同決定植物適應水分脅迫的能力[25]。植物氣孔特征與葉片形態特征對環境變化的適應存在一定的協同變異性,但這種關系不具有普適性,主要與氣孔特征和葉片功能性狀的選擇壓力存在差異以及物種分布相關[26]。

5 總結

生境復雜多變,生活在其中的植物改變生理、形態與結構做出響應,通過多種性狀的組合來適應變化的環境。植物對環境的響應是一個復雜的、綜合的過程,是各個功能性狀相互協調、相互配合的過程。不同種植物或同一種植物葉片對環境中的生態因子敏感程度有所不同,對環境變化的適應具有多樣性。

林下的山東銀蓮花具有更高的光合能力,山頂的具有更好的水分利用效率和保水能力,都能有效協調碳同化和水分利用,表現出良好的適應能力。

山東銀蓮花分布狹域、稀有、種群小,具有重要價值,存在兩種對比鮮明的異質生境,是理想的研究生態適應策略和適應機制的非模式植物材料。對它的研究既能為今后的保護和利用服務,同時為將來研究山東銀蓮花適應性的分子機制打下基礎,為其他植物的研究提供理論參考。