秸稈顆粒還田對黑土土壤酶活性及細菌群落的影響

徐忠山,劉景輝,逯曉萍,武俊英,李金龍,陳曉晶,張博文,張興隆,楊彥明,*

1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 呼和浩特 010019 2 阿榮旗農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心, 阿榮旗 162750

作為世界三大黑土區(qū)之一的東北黑土區(qū)是我國最重要的商品糧基地,在國家糧食安全中有舉足輕重的地位[1]。黑土因腐殖層厚、肥力高、團粒結(jié)構(gòu)好等特性,成為珍貴的土壤資源。而土壤酶活性和微生物是評價土壤質(zhì)量的重要指標,對促進有機質(zhì)分解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化十分重要,兩者對各種農(nóng)業(yè)管理措施如秸稈還田、施肥及耕作方式等變化較敏感[2- 5]。我國的秸稈資源十分豐富,據(jù)統(tǒng)計全國每年共產(chǎn)生秸稈數(shù)量為6.2億t,約占世界的20%—30%[6]。農(nóng)作物秸稈作為物質(zhì)、能量和養(yǎng)分的載體,成為寶貴的生物質(zhì)資源,目前秸稈利用主要以直接還田為主[7]。Tejada等[8]研究表明秸稈還田可改善土壤結(jié)構(gòu),Li等[9]發(fā)現(xiàn)不同形式秸稈還田均能提高土壤蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶及堿性磷酸酶活性[10]、增加土壤微生物生物量碳氮[11]、提高細菌群落多樣性[12]、進而改善土壤生物學性狀[13]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,秸稈直接還田常因粉碎不徹底、病蟲寄居等原因,導致作物播種質(zhì)量差、與作物爭奪養(yǎng)分和水分、加重病蟲草害及增加溫室氣體排放等問題[14- 17]。目前,關(guān)于秸稈還田方式、還田量等方面的研究雖然較為常見,但關(guān)于秸稈顆粒還田的相關(guān)研究鮮見,尤其針對秸稈顆粒還田對東北黑土地土壤酶活性及微生物群落的相關(guān)研究未見報道。鑒于此,為明確不同秸稈顆粒還田量對黑土酶活性及微生物群落的影響,本試驗通過6種秸稈顆粒還田處理,連續(xù)2年大田定位試驗,研究不同秸稈顆粒還田量對黑土4種土壤酶活性、微生物生物量及微生物群落及結(jié)構(gòu)的影響,以期為秸稈合理高效利用、增強黑土可持續(xù)生產(chǎn)能力提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗于2016—2017年在內(nèi)蒙古興安盟扎賚特旗農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)開展,該地區(qū)屬溫帶大陸性半干旱季風氣候區(qū),年均日照為2855 h,常年積溫2600℃左右,無霜期110—135 d,海拔高度203 m,土壤類型為草甸土,pH為8.22。試驗地養(yǎng)分狀況見表1,試驗期間降雨量和氣溫變化見圖1。

表1 試驗地養(yǎng)分狀況表(0—20 cm)

圖1 試驗期間降雨量和氣溫變化Fig.1 Variations of daily rainfall and air temperature during experimental period

1.2 試驗設計

目前大多數(shù)關(guān)于玉米秸稈還田試驗秸稈還田量均為0、30%、60%及100%還田,本試驗設秸稈0還田,還田量0 kg/hm2(CK)、秸稈60%還田,還田量4500 kg/hm2(JG1)、秸稈70%還田,還田量5250 kg/hm2(JG2)、秸稈80%還田,還田量6000 kg/hm2(JG3)、秸稈90%還田,還田量6750 kg/hm2(JG4)和秸稈100%還田,還田量7500 kg/hm2(JG5)6個處理,各小區(qū)采用隨機區(qū)組設計,重復3次,小區(qū)面積13.2×10=132 m2。前季玉米收獲后將地上部分自然風干,收割回收后用粉碎機把秸稈揉搓、粉碎至10—20 mm,用生物質(zhì)顆粒機(型號KWLH- 628,江蘇金梧實業(yè)股份有限公司)制得直徑3—4 mm、長度30—50 mm的棒狀圓柱體,冷卻后存放于干燥室備用。播前一周,移除地上全部秸稈和根茬,后將秸稈顆粒均勻撒施入各小區(qū),隨即進行旋耕作業(yè),深度20 cm。2016—2017年均為5月10日播種,玉米品種為恒育498,采用大壟播種機播種,播量22.5 kg/hm2,行距66 cm,株距25 cm,保苗數(shù)60000 株/hm2?；孰S播種機施入,尿素150 kg/hm2、磷酸二銨225 kg/hm2,不追肥。于5月26日、7月12日灌水兩次,灌水量900 m3/hm2,10月10日收獲。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 土樣采集與分析

于2016、2017年10月玉米收獲后每小區(qū)按“S”型取樣法取6個處理0—20 cm土壤樣品,混合作為該處理的一個樣品,每個處理重復3次。土樣裝入無菌密封袋,后置于保溫箱帶回實驗室,立即測定土壤生物學性質(zhì)。2016年10月采集玉米根際土樣,低溫運輸至北京諾禾致源生物信息科技有限公司測定土壤微生物群落。土壤過氧化氫酶活性采用微量滴定法測定[18]；蔗糖酶采用二硝基水楊酸比色法測定[18]；堿性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定[18]；土壤脲酶采用靛酚藍比色法測定[19]。土壤微生物生物量碳采用熏蒸提取-容量分析法測定,土壤微生物生物量氮采用熏蒸提取后凱氏定氮法測定[20]。

1.3.2 基因組DNA的提取和PCR擴增

采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進行提取,之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量的樣品于離心管中,使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶 Barcode 的特異引物,New England Biolabs 公司的 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,和高效高保真酶進行PCR,確保擴增效率和準確性。鑒定細菌多樣性引物對應區(qū)域：16S rRNA基因V4區(qū)引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT- 3′)。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣,充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.3.4 文庫構(gòu)建和上機測序

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后,使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

測序數(shù)據(jù)處理以及OTU聚類和物種注釋方法參照方偉等人的研究[21]。使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計算樣品復雜度,并進行多樣品比較分析。分別使用R軟件(Version 2.15.3)繪制PCoA圖和稀釋曲線。試驗中數(shù)據(jù)采用 Excel 2003 和 SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析。圖表數(shù)據(jù)均是平均值±標準誤。

2 結(jié)果

2.1 不同處理對土壤酶活性的影響

由圖2可知,2016與2017年秸稈還田明顯提高了4種酶活性,2016年蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶與堿性磷酸酶活性較CK分別提高了4.7%—47.3%、5.2%—52.6%、5.0%—18.0%和11.0%—60.2%,JG2與JG4處理酶活性較高；2017年各處理土壤酶活性表現(xiàn)與2016年基本一致,尤以JG4處理酶活性最高。各處理4種酶活性明顯高于CK,且隨著秸稈還田量的增加,土壤酶活性總體上呈升高趨勢,當還田量達到6750 kg/hm2時,酶活性達到最大值,繼續(xù)增加還田量,土壤酶活性下降。連續(xù)兩年秸稈還田與還田一年相比,過氧化氫酶活性顯著提高,脲酶與堿性磷酸酶活性顯著降低(P<0.05)。

圖2 2016—2017年各處理土壤酶活性變化Fig.2 Soil enzyme activities relative to treatments during 2016—2017不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05);CK：對照處理,即秸稈0還田；JG1：秸稈1處理,即秸稈60%還田；JG2：秸稈2處理,即秸稈70%還田；JG3：秸稈3處理,即秸稈80%還田；JG4：秸稈4處理,即秸稈90%還田；JG5：秸稈5處理,即秸稈100%還田

2.2 不同處理對土壤微生物生物量碳氮的影響

如圖3所示,2016和2017年各處理均未顯著提高土壤微生物生物量氮含量(P<0.05),2016年和2017年各處理較CK分別提高34.33%—80.43%和16.37%—51.43%,分別為JG4和JG3處理含量最高。2016年土壤微生物生物量碳含量顯著高于2017年(P<0.05),2016年和2017年各處理較CK分別提高1.31%—2.63%和3.25%—7.07%,分別為JG4和JG1處理含量最高。

秸稈改善土壤結(jié)構(gòu),提高土壤肥力,促進微生物繁殖與生長,提高土壤酶活性。各處理微生物生物量碳氮均明顯高于CK,2016年與2017年均表現(xiàn)為JG1和JG4處理微生物量碳氮含量較高,隨還田量增加,微生物生物量碳氮均呈增加趨勢,JG4與JG5處理最佳。由于2017年的高溫及降雨影響,微生物量碳含量顯著低于2016年,JG1、JG2與JG4處理微生物生物量氮含量也小幅降低。

圖3 2016—2017年各處理土壤微生物生物量碳氮含量Fig.3 Soil microbial biomass carbon and nitrogen content under different treatments during 2016—2017

2.3 各處理對測序深度及多樣性指數(shù)的影響

由表2可知,各處理的土樣OTU數(shù)量在 3713—3913之間,JG1、JG2與JG5處理OTU數(shù)量顯著高于CK,表明秸稈施入土壤提高了細菌多樣性,且JG1處理的總OTU數(shù)量最高,全部處理測序深度指數(shù)均達到99%。由表2可知,各處理ACE和Chao1數(shù)值差異顯著,JG1和JG2處理顯著提高ACE和Chao1指數(shù),而JG3、JG4和JG5的ACE和Chao1數(shù)值較CK明顯降低,表明秸稈還田會對細菌的豐富度和多樣性產(chǎn)生影響,但其影響程度會因還田量的不同而差異較大。各處理Shannon和Simpson數(shù)值差異顯著,JG1、JG2和JG3處理二者數(shù)值均顯著高于CK,JG4和JG5處理顯著低于CK(P<0.05),表明秸稈還田會對細菌的群落多樣性產(chǎn)生影響,且影響程度與還田量有關(guān)。ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)均為JG1處理最高。

表2 16S rRNA 基因 OTU 數(shù)、豐富度和多樣性指數(shù)

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

圖4 不同處理主坐標分析Fig.4 Principal coordinate analysis of different treatments

基于Weighted Unifrac距離來進行PCoA分析,并選取貢獻率最大的主坐標組合,結(jié)果見圖4。各處理的3個重復距離較接近,表示同一處理的樣品群落結(jié)構(gòu)相似度較高,而秸稈還田對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響因還田量不同差異很大。PC1和PC2 兩個軸分別解釋了44.23%和30.35%的細菌群落變化。各處理土壤細菌群落在分布上存在著不同,JG1和JG3處理、JG4和JG5處理在PC1軸上的投影較為接近,但與CK處理相距較遠,而JG2和CK處理在PC1軸上的投影接近,說明秸稈還田量是影響細菌群落變化的主要因素；整體來看,JG2和CK處理的細菌群落結(jié)構(gòu)都分布在中部,JG1處理分布在左側(cè)方,JG3處理分布在上方,JG4和JG5處理分布在右側(cè)方,說明JG2和CK處理、JG4和JG5處理的細菌群落結(jié)構(gòu)聚集程度最接近。

2.4 各處理對細菌群落構(gòu)成的影響

如圖5所示,群落構(gòu)成其中相對豐度最高的菌門為變形菌門(Proteobacteria),占33.0%—44.1%,隨后依次是放線菌門(Actinobacteria)23.3%—34.3%、酸桿菌門(Acidobacteria)6.3%—15.1%、擬桿菌門(Bacteroidetes)4.5%—6.9%、綠彎菌門(Chloroflexi)2.3%—4.2%、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)2.5%—4.0%、浮霉菌門(Planctomycetes)0.9%—4.4%、厚壁菌門(Firmicutes)1.0%—2.6%、疣微菌門(Verrucomicrobia)0.8%—1.8%、奇古菌門(Thaumarchaeota)0.2%—0.8%和其他2.8%—3.9%。

圖5 門水平上最大豐度排名前10的物種相對豐度柱形圖Fig.5 Relative average abundances of the ten most abundant phyla of phylogenetic phylum

秸稈還田各處理變形菌門的相對豐度顯著高于CK及JG1處理,隨還田量增加,其豐度越高。變形菌門包括豐富的固氮細菌,秸稈還田可提高土壤固氮能力,與本試驗微生物生物量氮及脲酶活性表現(xiàn)一致。放線菌門多為致病細菌,秸稈還田各處理放線菌門相對豐度顯著低于CK及JG3處理,致病細菌減少,降低了土壤病害發(fā)生概率。厚壁菌門可以抵抗脫水和極端環(huán)境,能夠分解土壤中脂肪和碳水化合物等物質(zhì),同時還能抵御外來病原體的入侵。各處理厚壁菌門相對豐度明顯高于CK,較高含量的厚壁菌門可以更好地分解土壤養(yǎng)分,供玉米吸收利用,同時提高土壤抵御外來病原體能力。如表3所示,與CK相比,秸稈還田處理提高了厚壁菌門、疣微菌門、變形菌門和擬桿菌門豐度,且JG4與JG5處理豐度增加最多,主要包含F(xiàn)usibacter、Stenotrophomonas、Zoogloea、Desulfovibrio、Pannonibacter與Mangroviflexus等,出現(xiàn)的新細菌主要涉及固氮、吸磷及改良重金屬污染土壤等功能,此外還有4個屬未能注釋。

表3 OTU水平下不同處理排名前10的特有物種相對豐度

2.5 各處理影響土壤細菌菌群結(jié)構(gòu)的因子分析

圖6 不同處理土壤生物學性質(zhì)與細菌群落(門水平)的冗余分析Fig.6 Results from redundancy analysis to explore the relationship between soil bacterial community (phylum) and soil biological characteristics

圖6的RDA分析表明,兩個主要軸特征值分別為48.33%和19.20%；兩個軸相互垂直,相關(guān)系數(shù)為0,說明RDA的排序結(jié)果是可信的[22]。不同秸稈還田量微生物群落變化差異明顯,JG4與JG5處理在第一排序軸的正端,其他4個處理在序軸負端；CK、JG2與JG3處理在第二排序軸的正端,而JG1、JG4與JG5處理在序軸負端。第一軸排序與微生物生物量碳(相關(guān)系數(shù)為0.992)、過氧化氫酶(0.989)、脲酶(0.960)、堿性磷酸酶(0.865)與微生物生物量氮(0.728)呈正相關(guān)；第二軸排序與脲酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶、微生物生物量碳、氮無明顯相關(guān)性。結(jié)果表明影響微生物群落多樣性較大的環(huán)境因子為微生物生物量碳氮含量及脲酶活性。

3 討論

3.1 各處理對土壤酶活性及微生物生物量的影響

秸稈還田能提高土壤脲酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性,且酶活性提高程度與秸稈還田量相關(guān)[7,23]。本研究驗證了前人試驗結(jié)果,秸稈還田各處理4種酶活性明顯高于CK,且隨還田量增加,土壤酶活性總體上呈上升趨勢。秸稈本身含有大量的酶,施入土壤分解后也可為土壤帶來酶和有機物質(zhì)等,提升土壤肥力,提高土壤微生物數(shù)量,微生物的增加又會加快有機物質(zhì)的分解,改善土壤環(huán)境,更適合微生物生長與繁殖[24- 25]。研究表明50%秸稈還田處理對微生物量碳、氮的提高作用最明顯(P<0.05),表明50%秸稈還田量的C/N 更適合土壤微生物生存,土壤微生物數(shù)量和活性也隨之提高,又進一步提高土壤酶等分泌物的數(shù)量,酶活性提高又促進微生物分解[5]。本試驗JG4處理微生物生物量碳氮含量均最高,可能是該還田量下C/N(6.44)更適宜微生物生長。前人研究發(fā)現(xiàn)兩季秸稈均還田可顯著提高土壤微生物量碳氮及酶活性,翻耕和旋耕兩季秸稈還田處理土壤微生物生物量碳含量均顯著高于其他處理[26]。本研究表明,2016和2017年各處理微生物量碳氮含量均顯著高于CK(P<0.05),連續(xù)秸稈還田土壤微生物量碳及部分處理的微生物量氮含量反而低于2016年,可能是2017年拔節(jié)期干旱少雨而灌漿期持續(xù)降雨對土壤水熱狀況產(chǎn)生影響,導致微生物量碳氮含量降低。

3.2 各處理對測序深度及多樣性指數(shù)的影響

從OTU數(shù)量可以看出,各處理特有OTU數(shù)量均高于CK與JG3,且JG1處理OTU數(shù)量最多,表明秸稈還田增加土壤OTU數(shù)量,提高了細菌多樣性。高圣超等[27]研究發(fā)現(xiàn)施入有機肥提高了土壤細菌的16S rRNA 基因拷貝數(shù),Teixeira等[28]與其研究結(jié)果相似,本研究結(jié)果與前人研究一致。從α多樣性指數(shù)(Chao1 和 ACE 指數(shù))看出,秸稈還田對細菌的豐富度與多樣性的影響程度因還田量的不同差異較大?？赡苁峭寥拉h(huán)境改變造成的,秸稈還田能改善土壤性狀、增加有機質(zhì)含量、提升肥力并改善土壤水熱狀況,為微生物提供適宜生長環(huán)境[29- 30]。分析β多樣性指數(shù)(Shannon 和 Simpson 指數(shù)),秸稈還田對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響因還田量不同差異很大,CK和JG2處理細菌群落結(jié)構(gòu)聚集程度最優(yōu),而與其他各處理差異很大。秸稈還田改變土壤細菌的菌群結(jié)構(gòu),對黑土地的發(fā)展產(chǎn)生重要影響。

3.3 各處理對細菌群落構(gòu)成的影響

JG1處理OTU數(shù)量最高,但變形菌門等有益菌豐度較低,明顯提高放線菌門等致病菌豐度；JG4和JG5處理雖然總OTU數(shù)量低于CK,但有益菌豐度明顯升高,致病菌豐度明顯降低,保持了良好的土壤細菌群落結(jié)構(gòu)。變形菌門、放線菌門和酸桿菌門豐度值占所有優(yōu)勢菌門的70%以上,這與前人研究結(jié)果一致[24]。長期施肥砂姜黑土的細菌群落研究發(fā)現(xiàn),NPK施肥處理降低了土壤細菌群落的多樣性[31],長期施用化肥降低土壤細菌群落多樣性,結(jié)合本研究,通過秸稈還田或秸稈與無機肥料配施可能提高土壤細菌群落的多樣性。本研究表明,秸稈還田提高土壤變形菌門相對豐度,提升土壤固氮能力；放線菌門相對豐度減少,降低土壤遭受病害概率；秸稈還田還提高厚壁菌門相對豐度,參與土壤養(yǎng)分分解,供玉米生長所需,同時提高土壤抵御外來病原體能力。王伏偉等[32]研究表明,施肥增加了土壤中放線菌相對豐度,這與本試驗結(jié)果相反。Ai等[33]對31年玉米-小麥輪作土壤細菌菌群分析表明施肥處理嗜酸菌門豐度明顯高于CK,這與本研究結(jié)果不同,原因可能是本試驗地為長年玉米連作,土壤與玉米-小麥輪作有所差異。本試驗JG1、JG2處理嗜酸菌門相對豐度高于CK,而JG3、JG4和JG5處理低于CK。秸稈還田處理較CK新增了Fusibacter、Stenotrophomonas、Zoogloea、Desulfovibrio、Pannonibacter與Mangroviflexus等。其中,Zoogloea屬于γ-變形菌綱,目前國內(nèi)外大量研究表明Zoogloea是某些區(qū)域活性污泥法強化除磷系統(tǒng)中的主要功能菌株之一[34],還能夠吸收磷,并將其以多聚偏磷酸鹽的形式貯存在細胞中[35]。近年來,一些Desulfovibrio物種已經(jīng)顯示出通過還原性生物蓄積過程對有毒放射性核素具有生物修復潛力[36],也有研究表明Pannonibacter可適應于高pH、高Cr(Ⅵ)含量污染土壤中的生長[37],對改良重金屬土壤意義重大。

4 結(jié)論

秸稈顆粒還田能顯著提高4種土壤酶活性及微生物量碳氮含量；提高了變形菌門和厚壁菌門的相對豐度,尤以JG4與JG5處理效果最佳；JG3處理放線菌門豐度高于CK,而其他處理均降低了放線菌門相對豐度；與CK相比,秸稈顆粒還田處理過程中出現(xiàn)具有固氮、吸磷、改良重金屬土壤等特性的細菌,可見玉米秸稈還田具有重要的生態(tài)學意義,可在一定程度上增加細菌數(shù)量和種類多樣性,進而使土壤系統(tǒng)向穩(wěn)定健康的方向發(fā)展。綜合研究結(jié)果,在本試驗條件下以6750 kg/hm2為較適宜的玉米秸稈顆粒還田量。