基于腎藏精理論對魚鰾治療男性不育癥的實驗研究?

劉美琪，湯軼波，鄭燕飛，白 雪，譚天陽，李 月，李韻歆，馬 茹，陳亞飛，劉振權△，王 琦△

(1. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488； 2. 北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029)

近年來，我國男性精子質量普遍下降，男性不育已成為全社會普遍關注的問題[1]。研究發現，少弱精、無精患者約占男性不育的48.49%[2]。發展中國家和工業化國家生育率的逐漸降低，雖然部分歸因于社會經濟和文化的改變，但環境對男性生殖系統的損害仍是其中不可忽視的重要因素[3]；男性生殖系統對環境暴露十分敏感，現代化生活中的工業污染、不良習慣、電子設備輻射等均與男性生殖功能受損直接相關[4-5]。男性不育患者社會壓力大、家庭關系緊張[6]，因此男性不育癥的防治已成為社會公共衛生領域面臨的幾大挑戰之一。

中醫學認為腎藏精，主生殖，治療男性不育應以補腎論治。專長治療男科疾病的國醫大師王琦教授認為，男性不育的主要病機為“腎精虧虛，兼夾病邪”[7]，其臨床治療少弱精子多加以中藥魚鰾組方，取得良好療效。

魚鰾性味甘平、入腎經，具有補腎益精、滋陰養血的功效，用于治療腎虛滑精所致的男性不育、腰膝酸軟[8-9]。《本草求原》記載，魚鰾有“養筋脈，定手戰，固精”的功用[10]，現代《浙江省中藥炮制規范》是最早收錄魚鰾的炮制規定[11]。然而，魚鰾改善精子質量的藥理實驗研究目前尚少見報道。本實驗通過研究魚鰾對少弱精子小鼠精子質量的改善作用，為臨床應用魚鰾防治男性不育癥提供基礎研究支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD小鼠48只，體質量18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供*許可證號SCXK(京)2016-0006)。小鼠均自由飲水和采食，每天更換墊料及飼料，保持環境干燥清潔，環境溫度23±2 ℃。

1.1.2 實驗用藥及試劑 魚鰾：飲片購買于北京同仁堂北苑店；五子衍宗丸：購自北京同仁堂股份有限公司(批號17035273)。環磷酰胺：由Baxter Oncology GmbH生產(批號7J193A)；培養基M199(Life Technologies Corporation)(批號1917554)。

1.1.3 主要實驗儀器 精子分析儀：清華同方3.0版，熱臺：DB-B2，徠卡微軟韋茨拉有限公司；移液器：Easypet3，艾本德中國有限公司北京分公司；天平：TE4101，北京賽多利斯儀器和系統工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 小鼠適應性喂養1周，按隨機數字表法分為正常組、模型組、魚鰾低、中、高劑量組、五子衍宗丸組，每組各8只。除正常組外，其余各組小鼠均腹腔注射環磷酰胺60 mg/kg，持續5 d，建立少弱精子模型。從第6天開始，正常組和模型組以蒸餾水灌胃。魚鰾低、中、高各劑量組以人體等效劑量5、10、20倍用量灌胃魚鰾水煎液，分別為1.42 g/kg、2.85 g/kg、5.71 g/kg。魚鰾飲片水煎液制備方法為純凈水浸泡0.5 h，大火煎煮0.5 h。五子衍宗丸組以五子衍宗丸灌胃(1.71 g/kg)，每日1次，連續灌胃2周。末次給藥后，禁食12 h并處死小鼠，進行后續檢測。

1.2.2 睪丸與附睪指數 取小鼠睪丸和附睪稱重，計算睪丸重/體質量和附睪重/體質量。

1.2.3 測試精子質量 根據參考文獻[12]，用手術剪刀迅速分離附睪尾，并分離附睪尾上的脂肪組織，將附睪尾放入提前預熱37 ℃的M199培養基中，將附睪尾剪碎輕輕震蕩均勻，使精子充分游出。取10 μL精子懸浮液放入精子計板上，選取6個視野，于2 min內完成測試。主要檢測指標為精子濃度(×106/ml)、精子活力(%)、精子活率(%)、精子畸形率(%)。

1.3 統計學方法

2 結果

表1顯示，腹腔注射環磷酰胺后，模型組小鼠精子濃度、精子活率與精子活力均顯著低于正常組(P<0.05)，精子畸形率與正常組比較顯著增加(P<0.05)，附睪指數、睪丸指數與正常組比較明顯下降(P<0.05)，差異有統計學意義，提示造模成功。

表1顯示，連續給藥2周后，五子衍宗丸組與魚鰾高、中、低各劑量組小鼠精子濃度、精子活率和精子活力均明顯高于模型組(P<0.05)，五子衍宗丸與魚鰾高、中劑量組小鼠精子畸形率較模型組有顯著降低(P<0.05)，五子衍宗丸與魚鰾高、中、低劑量組小鼠睪丸指數、附睪指數顯著高于模型組(P<0.05)，差異有統計學意義。

表1 魚鰾對少弱精子癥小鼠精子質量的影響

注: 與正常組比較:#P<0.05; 與模型組比較:*P<0.05

3 討論

現代醫學認為，少弱精子癥多由精索靜脈曲張、內分泌失調、微量元素缺乏以及不健康的生活方式等因素導致[13]。精子濃度、精子活力、精子活率和精子畸形率為評價精子質量的重要指標，精子質量越高說明受孕的幾率越大。其中精子濃度為每1 ml精子懸浮液中所含精子量；精子活力為樣品中向前運動精子占精子總數的百分比，即a級+b級精子占總精子的百分率；精子活率為樣品中運動精子占總精子數的百分率，即a級+b級+c級精子占總精子的百分率；精子畸形率表示精子形態發生變異的精子占總精子的百分率[14-15]。

環磷酰胺是烷化劑類抗腫瘤藥物，具有較強的免疫抑制作用，可對男性生殖系統造成損傷，導致精子染色體突變、無精癥或少精癥[16-17]。腹腔注射環磷酰胺可導致小鼠精子畸形率升高，精子數、精子活力和生存能力明顯降低[18]；損傷大鼠睪丸組織形態，增大睪丸生精小管間隙，使各級生精細胞分布密度下降[19]。故本實驗采用環磷酰胺制備少弱精子癥模型，經腹腔注射環磷酰胺后，小鼠表現為精神萎靡不振，蜷縮畏寒，類似于中醫腎虛證；模型組精子濃度、精子活力、精子活率和精子畸形率較正常組明顯下降，與其他相關研究結果相符，由此可推測造模成功。

治療男性不育的相關研究進展緩慢，現代醫學主要應用L-肉堿類和激素類藥物，但上述藥物單用效果不顯著，易產生藥物依賴，且激素副作用較大，臨床上應用受到限制[20]。《素問·六節藏象論篇》記載：“腎者主蟄，封藏之本，精之處也。”中醫學認為，腎為先天之本、藏精之處，腎氣是否充足、腎精是否充盈，與生殖機能的強弱息息相關；男性不育癥的病機常為腎虛，應從補腎益精種子為主旨[21-22]。

魚鰾素有“海洋之參”的美譽，最初外用治療出血、瘡瘍，明清后主要用于補腎固精。清代《本草新編》有云：“魚鰾，味甘，氣溫，入腎經。專補精益陰，更能生子。[23]”《外科大成》記載其“治遍身酸軟作痛者、腰痛”[24]。《本草撮要》記載：“線魚鰾，味甘咸，入足陰明經，功專補益精氣。[25]”魚鰾更為“血肉有情之品”，具有滋陰補腎、填精養血的功效，臨床多用于治療腎虛封藏不固導致的夢遺滑泄、腰膝無力。應用魚鰾治療少精弱精癥的方劑亦有諸多記載，如《本經逢源》記載了魚鰾膠入丸炮制方法，以及魚鰾與沙苑蒺藜組方而成的固精丸，用于腎虛不固、遺精滑泄[26]；《拔萃良方》收載的魚鰾丸在前者基礎上增添了當歸、肉蓯蓉、蓮須與菟絲子，治療腎陰不足之癥[27]；《證治準繩》中，聚精丸則較固精丸增加五味子，制蜜丸治療腎虛滑精[28]。

王琦針對男性不育疾病提出的“精室論”假說[29]，打破傳統中醫單純補腎的觀念，認為精室為腎所屬，而與腎經和督脈相通，主生精、泌精液；精室之病主要為精液病，包括少精、無精、弱精和精冷等。臨床少弱精子不育患者主要以腎陰、腎精虧虛為主，可兼有濕熱、瘀(精瘀血瘀)、毒(有害環境)或蟲(微生物感染)。王琦創制的男性不育主方“升精贊育湯”，方用生地黃、桑椹、枸杞以滋陰補腎，紫河車補腎益氣，巴戟天、仙靈脾溫陽化氣，茯苓、澤瀉以滲泄濕熱，牡丹皮以涼血化瘀。在實際辨證治療中，需結合患者具體癥狀對該主方進行加減調整，尤其針對少弱精子者，為保契合病機，在前期補腎獲效后，常取“精血相生”之法調整組方，加入“血肉有情之品”，魚鰾膠以增強本方劑補益精血的功效，氣血并補，往往取得良好療效[30-31]。

現代研究發現，氧化應激是造成男性不育的原因之一[32]。魚鰾中膠原蛋白的含量高達80%左右，魚鰾明膠具有較強的抗氧化能力[33]，魚鰾中的蛋白水解產物也有抗氧化、抗疲勞的作用，可能印證魚鰾“補腎”的功效[34-35]。魚鰾是否通過抗氧化應激等通路改善少弱精子，還有待進一步研究。魚鰾中氨基酸含量豐富、種類全面，其中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和精氨酸等含量最高，這些氨基酸在臨床已被用于維持前列腺健康、治療少精弱精癥，為魚鰾“補腎益精”提供理論基礎[36]。

精子活力與精子活率都是衡量精子質量的重要指標，尤其精子活力表示向前運動精子的百分比，能夠更加直觀地反映精子質量。在本研究中，魚鰾中、高劑量組小鼠的精子濃度、精子活率和精子活力與模型組比較均有顯著提升，表明魚鰾可以增加精子數量，提高精子運動活力，且成劑量相關性；此外，精子畸形表現為頭、體、尾的形態畸變，包括巨大頭、雙頭、體部折裂、卷尾、缺尾等[37]，臨床上畸形精子所占百分比用精子畸形率表示，超過30%時則為高畸形率精子，可對生育造成嚴重影響[38]。本實驗魚鰾中、高劑量組精子畸形率顯著降低，說明魚鰾也可能通過降低精子形態畸變改善男性不育癥，且隨著濃度增高，魚鰾降低精子畸形率的作用逐漸加強。魚鰾低劑量組的精子活力和精子畸形率未被改善，考慮原因可能是尚未達到合適的藥物治療窗。

臟器系數[39]是指實驗動物某臟器的質量與體質量的比值，臟器系數的降低提示該臟器發生萎縮或退行性病變。經魚鰾干預后，小鼠睪丸系數和附睪系數[40]明顯增加，說明魚鰾對環磷酰胺引起的睪丸、附睪的病理損傷有一定改善。綜上所述，魚鰾可以明顯提升少弱精子小鼠的精子質量，改善睪丸的退行性病變，對治療男性不育癥有較大的潛在價值，其藥理機制還需進一步的深入研究。