生地大黃湯通過干預緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1對自發性高血壓大鼠腦出血模型腦水腫的改善作用?

江 珊，俞曉飛，栗春梅

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院神經內科、神經病學研究所，上海 201203)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是臨床常見腦血管疾病，其高致殘率、高致死率嚴重影響患者的生活質量及生存指數，發病率占全部腦卒中的10%～15%，發病30 d死亡率接近50%，是第二大卒中類型[1-2]。腦出血后繼發一系列病理損害，其中最主要的是各種因素誘發的腦水腫，其嚴重程度是急性腦出血預后的重要預測指標[3-5]。Claudin-5、Occludin、Zo-1是血腦屏障結構中主要的緊密連接蛋白，對于維持血腦屏障功能，防止腦水腫至關重要[6]。本研究旨在研究生地大黃湯對自發性高血壓大鼠腦出血模型腦水腫的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級自發性雄性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)，由上海中醫藥大學實驗動物平臺采購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證號SCXK(京)2016-0006)，年齡3～4月，體質量(300±20) g。采用動物無創血壓測試儀(尾套法)測量收縮壓，收縮壓達到180～200 mmHg。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，標準飼料喂養，自由進水，動物房7∶00～19∶00光照周期模擬晝夜交替，相對濕度55%，溫度22 ℃。本實驗已通過上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查(倫理編號為PZSHUTCM170721001)。

1.2 主要儀器與試劑

生地大黃湯由生地黃、生大黃(上海中醫藥大學附屬曙光醫院中藥房)按3∶1比例水煎醇提濃縮制得，每毫升藥液中含2 g生藥；Occludin兔多克隆抗體(abcam,ab222691)、Claudin-5兔多克隆抗體(abcam,ab15106)、ZO-1兔多克隆抗體(abcam,ab216880)；乙醇、水合氯醛(武漢博士德生物工程有限公司)；腦立體定位儀(江灣Ⅰ型)；微量進樣器(上海高鴿科技有限公司)；MRI設備(PHILIPS-7D978E6，Philips Medical Systems)；電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；手術器械、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)等。

1.3 腦出血模型建立

采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型，具體模型建立和篩選步驟見前期已發表論文[7]。

1.4 分組與干預

27只SHR大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組和生地大黃湯組各9只。假手術組只開顱鉆孔進針，后2組采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型。造模后6 h生地大黃湯組灌胃生地大黃湯(18.5 g/kg/d)，假手術組和模型組灌胃等體積純水，每天1 次，連續干預3 d。

1.5 神經功能缺損評分

造模后3 h、1d、3 d各組取9只大鼠，按Longa 五級評分法[8]進行神經功能缺損評分；其中0分為無神經功能缺損，1分為動物不能完全伸直其前肢，2分為動物一側肢體癱瘓并有追尾現象，3分為動物不能站立、打滾，4分為無自發性活動、有意識障礙。造模后評分1～3 分認為腦出血造模成功。

1.6 腦水腫體積MRI檢測

造模后3 d各組取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，將大鼠俯臥于大鼠線圈進行MRI掃描，評估腦出血大鼠腦水腫情況，具體參數為T1：TR/TE=550/15，T2：TR/TE=4000/112，SL:2，FOV:100。根據系統自帶軟件勾畫計算腦水腫體積。

1.7 腦含水量測定

造模后3 d各組取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉，生理鹽水灌流心臟后取大鼠全腦，電子天平稱取濕重；電熱恒溫箱內70 ℃烘烤72 h，稱取干重。以(濕重-干重)/濕重×100%計算腦含水量，評價腦水腫程度。

1.8 Western blot檢測血腫周圍組織緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1

造模后3 d各組取3只大鼠取材。樣本離體后液氮速凍，-80 ℃冰箱內保存。選取血腫周圍腦組織，稱重20 mg，按試劑盒說明書進行勻漿、離心提取蛋白抽提液并測定濃度，電泳、轉膜、加一抗過夜，TBST清洗5 min×3次，加二抗，TBST清洗15 min×5次，顯影、曝光并掃描分析。

1.9 統計學方法

2 結果與分析

2.1 對神經功能缺損評分的影響

表1顯示，造模后3 h、1d，生地大黃湯組神經功能缺損評分與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)；造模后3 d,生地大黃湯組神經功能缺損評分低于模型組(P<0.05)。

2.2 對腦水腫的影響

表1圖1顯示，造模后3 d，模型組及生地大黃湯組大鼠可見血腫周圍腦水腫形成，其中生地大黃湯組腦水腫體積明顯輕于模型組(P<0.05)。

圖1 造模后3 d MRI檢測大鼠腦水腫(T2:TR/TE=4000/112,SL:2,FOV:100)

2.3 對腦含水量的影響

表1顯示，造模后3 d，模型2組較假手術組腦含水量增加，生地大黃湯組較模型組腦含水量明顯降低(P<0.05)。

2.4 對血腫周圍組織緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1的影響

表1圖2顯示，造模后3 d，模型組(ICH)、生地大黃湯組(RRD)緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1表達水平較假手術組(SHAM)降低(P<0.05)，生地大黃湯組Claudin-5、Occludin、Zo-1表達高于模型組(P<0.05)。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分、腦水腫程度、緊密連接蛋白/β-actin比較

注：與假手術組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05

圖2 Western blot檢測腦出血大鼠血腫周圍腦組織Claudin-5、Occludin、Zo-1的含量

3 討論

腦出血后血腫周圍腦組織水腫是主要的繼發性病理表現，由血腦屏障破壞引起的細胞外液體聚集導致血管源性水腫在腦水腫形成過程中至關重要[9]。血腦屏障由內皮細胞、星形膠質細胞、周細胞和基質構成，其中內皮細胞通過緊密連接蛋白相連[10]。Claudin-5、Occludin、Zo-1是緊密連接蛋白的主要成分，敲除Claudin-5基因小鼠的血腦屏障通透性增加，降低Occludin、Zo-1表達同樣加大了血腦屏障的滲透性[6]。

中醫藥治療急性出血性中風歷史悠久，并積累了豐富的臨床經驗。近年中醫藥因其多靶點、多途徑治療特點而備受關注。生地大黃湯為治療血證的著名古方，首見于唐·孫思邈《千金翼方》，藥用生地黃、生大黃。生大黃是治療急性腦出血的常用藥物[11]，其瀉熱毒、破積滯、行瘀血可改善血液循環，降低顱內壓，減輕腦水腫。單味中藥生地注射液對腦出血大鼠具有促神經修復及抗神經細胞凋亡作用[12]。生地黃甘寒滋陰止血，生大黃苦寒清熱活血，由生地黃和生大黃組成的古方生地大黃湯，用于治療急性出血性中風，共奏清熱滋陰、止血活血之功用。

本研究旨在探討生地大黃湯對自發性高血壓大鼠腦出血模型腦水腫的影響及其可能機制。結果顯示，大鼠腦出血模型造模后神經功能缺損明顯，加用生地大黃湯3 d，生地大黃湯組神經功能缺損顯著改善；大鼠腦出血模型造模后腦水腫體積、腦含水量明顯上升，加用生地大黃湯3 d，生地大黃湯組腦水腫體積減小，腦含水量明顯減輕。大鼠腦出血模型造模后血腫周圍腦組織Claudin-5、Occludin、Zo-1表達下降，加用生地大黃湯3 d，生地大黃湯組Claudin-5、Occludin、Zo-1蛋白水平表達上升。表明生地大黃湯對自發性高血壓大鼠腦出血模型腦水腫程度有明顯的改善作用，能減少腦水腫體積，降低腦組織含水量，緩解神經功能缺損，而其可能的機制與生地大黃湯干預緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1相關。