肝衰竭患者外周血Th17/Treg比率測定的價值及其與短期轉歸的關系

劉華春 楊根 鄭恒 胡巧 郭輝

研究表明，CD4+ T淋巴細胞參與肝衰竭進展過程，Th17、Treg細胞均為這類細胞的重要成員，對機體免疫有調節作用，可影響患者預后[1]。Th17細胞能分泌多種白細胞介素(IL)，包括IL-21、IL-17等[2]。有學者發現Th17細胞表達水平與肝功能損害程度有關[3]。Treg細胞在HBV相關肝炎中呈高表達，而對急性HBV感染者而言，早期呈低表達，隨著病情改善，其表達水平逐漸增高[4]。本研究旨在分析肝衰竭患者外周血Th17/Treg比率的變化，并探討其與短期轉歸的關系。

資料與方法

一、一般資料

選取廉江市人民醫院2016年5月—2018年5月收治的肝衰竭患者60例，將其作為肝衰竭組，選取同期收治的60例健康體檢者作為對照組。肝衰竭組男31例，女29例，年齡31～76歲，平均(59.78±16.59)歲；體質指數(18～24)kg/m2，平均(21.17±1.06)kg/m2；肝衰竭類型：急性肝衰竭34例，慢加急性肝衰竭26例。對照組男34例，女26例，年齡30～78歲，平均(60.72±15.24)歲；體質指數(18～24)kg/m2，平均(21.35±1.01)kg/m2。研究方案獲得本院倫理委員會批準，兩組基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

肝衰竭診斷符合我國《肝衰竭診治指南(2012年版)》標準[5]。納入標準：(1)診斷明確；(2)入院前6個月內無免疫調節、護肝治療史；(3)知情同意。排除標準：(1)惡性腫瘤；(2)酒精性肝病；(3)腎、心、腦等器官損害；(4)藥物性肝病；(5)自身免疫性疾病。

二、檢測方法

主要儀器包括離心機(邁克爾)、流式細胞儀(貝克曼庫爾特)，主要試劑包括紅細胞裂解液(博士德生物)、淋巴細胞分離液(博士德生物)、細胞固定破膜液(博士德生物)。Treg細胞檢測：取100 μL外周血，加CD25-PE、CD4-APC各10 μL，在4 ℃條件下反應30 min，將紅細胞溶解。固定破膜，取5 μL Foxp3-FITC及同型抗體加入，在4 ℃條件下反應30 min。洗滌，測定CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T細胞，獲得Treg細胞頻率。Th17細胞檢測：經淋巴細胞分離液將單個核細胞分離，細胞數調整為2×106/mL，加細胞刺激劑，在37 ℃環境下反應5 h，獲得細胞。取10 μL CD8-FITC、5 μL CD3-PERCP-CY5.5加入，在4 ℃條件下放置30 min，洗滌，測定CD3+CD8-IL-17A+/CD3+CD8- T細胞，獲得Th17細胞頻率。

三、觀察指標

觀察并比較兩組受檢者的Th17細胞頻率、Treg細胞頻率以及Th17/Treg。繪制ROC曲線分析其對急性肝衰竭的預測價值，獲得曲線下面積、最佳截斷值以及相應的敏感度、特異度。利用電話對肝衰竭患者進行6個月的隨訪跟蹤，記錄隨訪期間內的生存、死亡情況，并據此分成生存組、死亡組，比較兩組Th17細胞頻率、Treg細胞頻率以及Th17/Treg，繪制ROC曲線分析其對患者預后的預測價值。

四、統計學方法

結 果

一、肝衰竭組、對照組的Th17、Treg細胞及Th17/Treg比較

肝衰竭組Th17細胞、Th17/Treg水平高于對照組，Treg細胞低于對照組(P<0.05)。見表1。

二、各指標對肝衰竭的預測價值分析

Th17、Treg細胞及Th17/Treg預測肝衰竭的曲線下面積分別為0.669、0.696、0.710， Th17細胞>4.710%、Treg細胞<2.980%、Th17/Treg>2.401時，肝衰竭患病風險增加，見表2。

表1 肝衰竭組、對照組的Th17、Treg細胞及Th17/Treg比較(±s)

三、生存組、死亡組的Th17、Treg細胞及Th17/Treg比較

在隨訪期間，有14例死亡，占23.33%，46例生存，占76.67%。生存組Th17細胞、Th17/Treg水平低于死亡組，Treg細胞高于死亡組(P<0.05)。見表3。

表3 生存組、死亡組的Th17、Treg細胞及Th17/Treg比較(±s)

四、各指標對肝衰竭預后的預測價值分析

Th17、Treg細胞及Th17/Treg預測肝衰竭預后的曲線下面積分別為0.681、0.670、0.754， Th17細胞>6.625%、Treg細胞<1.859%、Th17/Treg>3.045時，肝衰竭患者死亡風險增加。見表4。

討 論

本研究發現與健康體檢者相比，肝衰竭患者的Th17細胞、Th17/Treg水平明顯增高，而Treg細胞水平下降。Th17細胞分化對局部微環境有較大依賴性，其分化最早經白介素-6、轉化生長因子-β刺激所引起，從而促進白介素-21分泌，促使Th17細胞增殖，這對白介素-23受體表達存在誘導作用，對機體免疫有調節作用。研究表明Th17細胞所分泌的因子參與了腫瘤、感染、宿主防御等病理改變進程，此外，IL-17R作為其受體，在肝臟中也有分布[6]。在感染早期階段，IL-17便能對炎癥反應進行介導[7]。本研究提示肝衰竭患者Th17細胞水平增高，這表明與之相關的炎癥因子也參與了該病進展過程，如IL-6、IL-17等。有研究發現，IL-17在血清中的表達與急性肝損傷程度呈正相關，當出現急性肝損傷時，IL-7在血清內含量明顯增高[8]，這為本研究提供了理論依據。

表2 各指標對肝衰竭的預測價值分析

表4 各指標對肝衰竭預后的預測價值分析

本研究繪制了ROC曲線，證實Th17、Treg細胞及Th17/Treg對肝衰竭的預測具有一定價值，其中以Th17/Treg比率的預測效果最好，臨床可將其作為這類患者的重點監測指標，便于進一步分析其病情變化。Treg與Th17的功能、細胞分化屬于相互抑制、制約的關系，當二者處于平衡狀態時，才能確保機體內環境穩定性，而一旦二者比率失衡，則會引起持續感染、惡性腫瘤等病變[9]。當肝臟受損后，IL-23分泌量增加，促進Th17細胞增殖，增加IL-22、IL-17等因子的分泌量，導致Th17型免疫應答形成[10]。在這種情況下，CD4+T細胞主要向Th17細胞分化，致Treg細胞分化減少，導致其水平下調。因此，肝衰竭患者的Th17細胞、Th17/Treg水平增高，Treg細胞下降。

本研究提示與死亡組相比，生存組的Th17細胞、Th17/Treg水平明顯下調，而Treg細胞水平上調，這表明Th17/Treg比率的失衡狀態逐漸得到糾正。通過繪制ROC曲線，提示Th17、Treg細胞及Th17/Treg能預測肝衰竭患者的預后。急性肝損傷會引起腸道菌群紊亂，引起血清IL-6、IL-23水平上調，導致Th17/Treg失衡，從而進一步破壞機體免疫，促進細菌易位。在經過治療后，患者的腸道菌群紊亂狀態逐漸糾正，有利于抑制IL-6、IL-23等因子的分泌，減輕機體炎癥，上調Th17/Treg比率。