小鼠肝庫普弗細胞鐵蓄積對急性肝損傷的影響

班凌偉 謝東 于淑清

鐵蓄積與肝損傷之間有著密切的聯系。一方面，鐵蓄積會導致或加重肝纖維化、肝細胞瘤，鐵過負荷會增加脂質過氧化并易化細胞凋亡[1]；另一方面，很多肝臟疾病都伴隨著鐵蓄積現象的存在，在酒精性肝病和丙型肝炎中，肝臟鐵蓄積是其常見的特性[2]。近年研究發現，在慢性活動性肝炎及肝硬化中，鐵主要蓄積在肝小葉外周區，為肝庫普弗細胞所吞噬，血色病患者的肝纖維化只發生在肝庫普弗細胞中鐵負荷過重的位置[3]，但是關于肝庫普弗細胞鐵蓄積與肝損傷關系的研究很少。因此，本課題通過對模型小鼠與正常小鼠注射CCl4造成急性肝損傷，來研究肝庫普弗細胞鐵蓄積是否會加重肝損傷，探討肝庫普弗細胞在其中發揮的作用，為進一步揭示鐵蓄積與肝損傷的聯系機制提供參考。

鐵轉運蛋白(Ferroportin，FPN)是目前唯一已知的鐵輸出蛋白[4]。肝庫普弗細胞是分布于肝臟中的一種巨噬細胞，在鐵離子代謝中，吞噬衰老的紅細胞而獲得鐵離子，在FPN的作用下將鐵離子轉運出細胞[5]。巨噬細胞FPN敲除是利用Cre/loxP系統，使FPN只在小鼠巨噬細胞特異性敲除，使巨噬細胞鐵無法轉運出，造成巨噬細胞鐵蓄積，而肝庫普弗細胞是巨噬細胞的一種，因此本課題采用巨噬細胞FPN敲除小鼠作為肝庫普弗細胞鐵蓄積模型小鼠。CCl4作為經典的劇毒類親肝毒物，對各種動物均可導致肝臟損傷，是常用的動物急性肝損傷模型[6]。

資料與方法

一、研究對象

雄性清潔級FPN-/-cre小鼠(肝庫普弗細胞鐵蓄積小鼠)和FPN-/-小鼠(正常小鼠)各16只，8周齡，體重(23～26)g。分別隨機分為兩組：FPN-/-cre小鼠對照組和實驗組；FPN-/-小鼠對照組和實驗組；每組8只。

二、實驗方法

(一)CCl4急性肝損傷模型的建立：對照組：橄欖油5 μL/g；實驗組：0.25% CCl45 μL/g；全部采用腹腔注射。

(二)標本的收集及肝勻漿的制備：禁食不禁水，24 h后稱取小鼠體重；取血測定血清中ALT、AST水平；處死小鼠，稱取完整肝臟重量，計算肝臟指數；取一部分肝組織制成10%肝臟組織勻漿，測定肝組織MDA、SOD、GSH含量。

(三)肝臟組織病理學觀察：取較為規則的一部分肝組織，經過固定、包被、包埋、切片處理后，HE染色，顯微鏡進行觀察。

三、統計學方法

結 果

一、小鼠肝臟指數、血清ALT、AST變化

兩實驗組肝臟指數、血清ALT、AST均高于其對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。說明經CCl4處理后，兩組小鼠肝臟均增大，CCl4建模成功。兩對照組肝臟指數、血清ALT、AST的差異無統計學意義(P>0.05)。FPN-/-cre實驗組肝臟指數、血清ALT、AST高于FPN-/-實驗組，差異有統計學意義(P<0.05)，因此在相同的CCl4處理下，FPN-/-cre小鼠比FPN-/-小鼠肝臟體積更大，肝損傷更嚴重。見表1。

表1 小鼠肝臟指數、血清ALT、AST比較(±s，n=8)

注：與FPN-/-對照組相比，aP<0.05；與FPN-/-cre對照組相比，bP<0.05；與FPN-/-實驗組相比，cP<0.05

二、小鼠肝組織MDA、SOD、GSH變化

兩實驗組MDA水平均高于其對照組，SOD、GSH水平均低于其對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。經CCl4處理后，兩種小鼠肝臟受到氧化損傷，CCl4建模成功。兩對照組MDA、SOD、GSH水平差異無統計學意義(P>0.05)。FPN-/-cre實驗組MDA水平高于FPN-/-實驗組，差異有統計學意義(P<0.05)。FPN-/-cre實驗組SOD、GSH水平低于FPN-/-實驗組，差異無統計學意義(P<0.05)。在相同的CCl4處理下，FPN-/-cre小鼠比FPN-/-小鼠肝臟氧化損傷更嚴重，主要表現為MDA增加(見表2)。

表2 小鼠肝臟MDA、SOD、GSH比較(±s，n=8)(nmol/mgprot)

注：與FPN-/-對照組相比，aP<0.05；與FPN-/-cre對照組相比，bP<0.05；與FPN-/-實驗組相比，cP<0.05

三、小鼠肝臟病理學情況

兩對照組肝細胞結構完整、清晰，排列有序，胞漿致密，核大而圓，兩組沒有顯著差異。FPN-/-實驗組肝細胞結構破裂，排列紊亂，包漿出現松散。FPN-/-cre實驗組肝細胞結構破裂、溶解，排列雜亂，包漿嚴重松散，局部還出現了出血點現象，是肝損傷的顯著標志。說明在同樣的CCl4處理下，FPN-/-cre小鼠比FPN-/-小鼠肝損傷更嚴重。見圖1。

注：A為FPN-/-對照組，B為FPN-/-cre對照組，C為FPN-/-實驗組，D為FPN-/-cre實驗組

圖1小鼠HE染色情況比較

討 論

肝臟指數是肝臟毒性試驗觀察中的重要指標，肝臟指數越大，表明肝損傷越重[7]。當肝細胞受損變性、細胞膜通透性增加時，從細胞內溢出的主要是血清ALT，當肝細胞嚴重病變、壞死時，線粒體內的AST會釋放到血液中。在鐵蓄積影響肝損傷的實驗研究中，大部分文獻報道不同原因的肝臟鐵蓄積均會使肝臟指數增大，血清ALT、AST水平升高，肝損傷加重[8]。本實驗中，在相同的CCl4處理下，FPN-/-cre小鼠肝臟指數、血清ALT、AST水平顯著性大于FPN-/-小鼠，說明與其他原因引起的肝臟鐵蓄積一樣，肝庫普弗細胞鐵蓄積同樣會加重肝損傷。證實了肝庫普弗細胞在鐵蓄積與肝損傷關系中的重要性，也一定程度上解釋了部分患者的肝纖維化只發生在肝庫普弗細胞中鐵負荷過重位置的現象。

很多機制推測解釋鐵蓄積影響肝損傷的原因，包括增加氧自由基，通過星狀細胞激活纖維形成，損害免疫反應等。二價鐵離子會與脂質過氧化物反應產生自由基，這些自由基會氧化各種細胞成分，導致細胞凋亡或其他細胞傷害，造成肝細胞損傷、肝纖維化

的發生。MDA是過氧化損傷的標志產物，其含量的高低可以靈敏的反映肝損傷強烈程度；SOD是一種存在于細胞液中的抗氧化酶，其活性的高低可間接反映機體抗氧化能力的強弱；GSH是細胞內重要的水溶性抗氧化劑，可清除O2-、H2O2等過氧化物[9]。在鐵蓄積影響肝損傷的實驗研究中，大部分文獻報道鐵蓄積會使小鼠肝臟MDA水平升高，SOD、GSH水平降低，肝臟氧化損傷加重[10]。本實驗中，在相同的CCl4處理下，與FPN-/-小鼠相比，FPN-/-cre小鼠肝臟MDA水平升高，差異具有統計學意義，SOD、GSH水平降低，差異不具有統計學意義。說明與其他原因的鐵蓄積影響肝損傷相比，肝庫普弗細胞鐵蓄積確實加重了肝臟的氧化損傷程度，主要表現為過氧化損傷產物MDA的生成增加，而抗氧化劑SOD、GSH的分泌無明顯增加，可能是機體對過氧化物的清除作用尚無明顯差異。在肝庫普弗細胞鐵蓄積加重肝損傷的過程中，鐵的過氧化可能具有一定作用，但具體機制仍需進一步探討。