Marc-145細胞為載體培養條件優化研究

趙 剛 閆 冰 劉鑫瑩

(哈藥集團生物疫苗有限公司,黑龍江哈爾濱 150069)

目前國內Marc-145細胞培養均采用轉瓶生產工藝，由于受到轉瓶表面積和培養條件的限制，生產細胞密度低，勞動強度大，操作過程易污染，疫苗質量難以得到保證。自從60年代微載體生物反應器培養技術建立以來，國外許多國家對其在疫苗生產中的應用進行了廣泛研究，本研究采用Marc-145細胞微載體培養，并對培養過程中的各項技術條件進行優化，從而總結出一套較為合理的生產工藝，為Marc-145細胞的大規模培養提供可靠的參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與微載體 Marc-145細胞（購自中國獸醫藥品監察所），微載體 Cytodex1（購自美國GE公司）。

1.1.2 試劑與儀器 新生牛血清（濟南勁牛生物科技有限公司）；0.25%胰酶（美國Gicbo公司）；MEM培養基（美國Gibco公司）；結晶紫細胞裂解液有哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心配制；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊有限公司）；二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher，參數設置：37℃，5% CO2）；細胞培養磁力攪拌器（美國Wheaton）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 Marc-145細胞復蘇培養

將細胞凍存管自液氮罐中取出，置37 ℃水浴，使管內凍存液迅速融化。常溫1000 r/min，離心5 min。棄去上清，用少量細胞生長液將細胞重懸后移入細胞培養瓶中，加入10 ml細胞生長液，于37 ℃、5 % CO2培養箱中靜置培養。待細胞長成單層后，用胰酶消化液消化，并按1：3的比率進行擴增培養。

1.2.2 微載體預處理

稱取所需質量的微載體Cytodex-1，按100 ml：1 g的比例用PBS浸泡微載體，輕微攪拌使微載體均勻浸泡3 h，121 ℃、滅菌30 min；倒掉PBS，以30 ml：1 g的比例用培養基將微載體洗滌2次，將微載體放置在4 ℃冰箱內平衡過夜，待用。

1.2.3 微載體細胞計數

取1 ml含微載體的培養液，900 r/min離心5 min，后棄掉上清，加入與上清相同體積的0.1%結晶紫溶液，混勻后于37 ℃中孵育1 h，然后用血球計數板計數釋放出來的細胞核，即為1ml培養液中的細胞數。

1.2.4 微載體培養Marc-145細胞試驗條件的優化

（1）攪拌轉速的確定

以微載體Cytodex-1用量為2 g/L、細胞接種密度為2×105cells/mL，加入細胞生長液后分別設定轉速為30、40和50 rpm培養細胞，每天取樣，觀察微載體上細胞吸附和生長情況，并采用結晶紫方法計數，確定出合適的攪拌速度。

（2）Marc-145細胞接種密度的確定

微載體Cytodex-1用量為2 g/L，分別以0.5×105、1.0×105、2.0×105和4.0×105cells/mL密度接種細胞。每天取樣，觀察微載體上細胞吸附和生長情況，并采用結晶紫方法計數，確定出合適的接種密度。

（3）微載體含量的確定

按照確定的接種密度2.0×105cells/mL與微載體用量2 g/L的比例關系，即在cells/g微載體相同的條件下接種Marc-145細胞，考察Cytodex-1含量分別為1 g/L、2 g/L、4 g/L微載體上細胞吸附和生長情況，并采用結晶紫方法細胞計數，確定出合適的微載體含量。

2 結果

2.1 Marc-145細胞培養

Marc-145細胞于傳代后3 d即可長成致密單層（圖1），在顯微鏡下可以觀察到，細胞形態良好，透光性好，界限清晰。

圖1 Marc-145細胞

2.2 攪拌轉速的確定

當轉速分別為30、40、50 rpm時培養細胞，細胞生長情況如圖2所示。從圖中可以看出，在培養過程中隨著攪拌速度的增加，細胞最大生長密度先升高后降低，當攪拌速度為40 rpm時，細胞密度最大為1.4×106cells/mL，培養效果最理想。因此本試驗攪拌速度采用40 rpm。

圖2 不同攪拌速度細胞生長曲線

2.3 細胞接種密度的影響

當微載體Cytodex-1用量為2 g/L，以0.5×105、1.0×105、2.0×105和4.0×105cells/mL密度接種細胞。每天取樣分析，細胞生長動力學過程如圖3所示。

從圖3可以看出，當微載體含量相等，接種密度不同時，細胞生長趨勢與文獻報道相似[75]。以0.5×105、1.0×105cells/mL接種時，接種密度低時，接種后84 h內仍在緩慢生長，沒有進入穩定生長期的明顯標志，而且細胞密度也比較低；而以2.0×105和4.0×105cells/mL接種細胞時，接種密度高，細胞在接種后60 h即開始進入穩定生長期，細胞密度較高都在1.4×106cells/mL以上。因此綜合考慮，本試驗選擇細胞的接種密度是2.0×105cells/mL。

圖3 不同接種密度Marc-145細胞生長曲線

2.4 微載體含量的確定

在微載體濃度為1 g/L、2 g/L、4 g/L的不同試驗條件下，每天分別從培養瓶中取樣并進行細胞計數，結果顯示當培養瓶中微載體的濃度為4 g/L時，培養到72 h時細胞密度最大為1.8×106cells/mL，培養效果最理想。細胞計數的結果如圖4所示，因此本試驗微載體含量采用4 g/L。

圖4 不同Cytodex-1濃度對Marc-145細胞生長曲線

3 討論

本研究通過設置不同攪拌轉速、細胞接種密度和微載體含量3個條件，研究了不同培養條件對Marc-145細胞生長的影響。

適當的攪拌速度對于微載體懸浮培養是非常重要的，若攪拌轉速過低，微載體有沉降的趨勢，細胞不僅不能均勻生長，而且會發生結團。若轉速提高，會促進營養物質的傳遞和供氧，有利于細胞的生長。但當轉速過高時，雖然細胞與微載體的接觸機率會相應的提高，但剪切力增加，對細胞的損傷也隨之增加，同時微載體間連接的細胞橋也會斷裂，細胞被拉長，裂解死亡。

當微載體含量相等時，以不同密度接種細胞，每個載體顆粒上開始的細胞數量不相同，細胞接種密度高時，每個微載體上的細胞數量增加，細胞在載體上分布比較均勻，細胞生長的空間大，不會或很少受到生長面積的限制，而且細胞消耗的營養物質和代謝產物的積累也相應降低，因此，細胞表現出較高的平均比生長速率。但細胞接種密度也不應過高，過高時由于受到生長面積的限制，細胞的擴展受到影響，使得平均比生長速率降低，同時降低了載體利用率。

本試驗比較了在不同微載體濃度Marc-145細胞的增殖狀況，摸索出了培養Marc-145細胞時最合適的微載體加入量，認為當加入的微載體顆粒濃度為4 mg/mL時，接種Marc-145細胞后是最有利于細胞增殖的，此時收獲的Marc-145細胞數量最多。另外，微載體濃度過高時，在懸浮培養的過程中顆粒之間相互碰撞的機率就會大大增加，造成微載體顆粒破碎和細胞脫落；另一方面，高含量載體培養時，在攪拌時，載體間碰撞幾率增加，會增加碰撞損傷細胞的機會，這也不利于細胞培養，而且，細胞的生長狀況如果不好，也會影響到接下來的病毒增殖過程。因此本試驗選擇的微載體濃度最高為4 g/L。

4 結論

攪拌轉速、細胞接種密度和微載體含量都會對Marc-145細胞增殖造成一定的影響，只有細胞生長條件適宜，才會最大程度的使細胞增殖，并達到預期效果，既設定攪拌速度為40 rpm、細胞接種密度為4.0×105cells/ml、微載體含量為4 g/L，培養72 h時，微載體上細胞匯合度大于90%，細胞密度最大為2.0×106cells/ml。