動物狂犬病的研究進展

洪都孜·波拉提 吳建勇 古努爾·吐爾遜 穆妮熱·喀迪爾 鐘 旗*

(1.新疆農業大學,動物醫學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學院獸醫研究所,新疆烏魯木齊 830013)

狂犬病（Rabies）是狂犬病毒所致的急性傳染病，多見于犬、狼、貓等肉食動物，人多因被病獸咬傷而感染。臨床表現為特有的恐水、怕風、咽肌痙攣、進行性癱瘓等。因恐水癥狀比較突出，故本病又名恐水癥（Hydrophobia）。動物通過互相間的撕咬而傳播病毒。我國的狂犬病主要由犬傳播，家犬可以成為無癥狀攜帶者，所以表面“健康”的犬對人的健康危害很大。對于狂犬病尚缺乏有效的治療手段，人患狂犬病后的病死率接近100%，患者一般于3～6 d內死于呼吸或循環衰竭，故應加強預防措施。

1 病原學

1.1 狂犬病病毒結構和分子生物學特點

狂犬病病毒屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒屬（Lyssavirus，LV），外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內含有單鏈RNA。是引起狂犬病的病原體。狂犬病毒具有兩種主要抗原：一種是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能與乙酰膽堿受體結合使病毒具有神經毒性，并使體內產生中和抗體及血凝抑制抗體，中和抗體具有保護作用；另一種為內層的核蛋白抗原，可使體內產生補體結合抗體和沉淀素，無保護作用。

已發現的LV除4種未分型外，其他分屬7個基因型，在歐洲大陸已發現了IRKV、WCBV和基因Ⅴ、Ⅵ型LV分布。該屬包括了12個已定種和2個暫定種，除RABV外其他種的病毒統稱為（rabiesrelated virus，RRV）。RABV基因組為單股負鏈不分節段RNA，全長約為12 kb。RABV五個結構基因編碼5個結構蛋白，分別是核蛋白（nucleoprotein，N），磷蛋白（phosphoprotein，P），基質蛋白（matrix protein，M），糖蛋白（glycoprotein，G）和病毒依賴的RNA聚合酶蛋白（RNA-dependent RNA polymerase，L）。L蛋白為最大結構蛋白，是一種多功能酶，主要負責病毒基因組復制、轉錄及轉錄后的加工。M蛋白為最小結構蛋白，是一種連接蛋白，在核衣殼和囊膜之間起著相互作用，并將兩者連接在一起，可直接影響G蛋白構型。目前研究發現，M蛋白似乎與宿主對狂犬病的免疫反應有關。

1.2 病毒的理化特性

Carnieli等[7]報道，狂犬病病毒不穩定，但能抵抗自溶及腐爛，在自溶的腦組織中可以保持活力7～10 d。對神經組織較強的嗜性是狂犬病病毒的主要特征，與其他組織細胞相比，狂犬病病毒在神經組織細胞中繁殖和復制的效率極高。狂犬病病毒對紫外線，日光，熱，干燥敏感，對其抵抗力較弱，一般加熱50℃ 1 h或加熱60℃ 5 min即可殺死病毒，該病毒對強酸，強堿敏感，容易被滅火。同時狂犬病病毒對甲醛，乙酸，碘，肥皂水，20%乙醚，10%氯仿以及離子型和非離子型去污劑均敏感，可滅火病毒[8]。病毒在凍干條件下可以長期存活，在50%甘油中保存的腦組織病毒至少可以存活一個月，4℃保存數周，低溫中保存數月至數年，室溫中保存不穩定。反復凍融可使病毒滅活，紫外線照射、蛋白酶、酸和季銨類化合物（如新潔爾滅）、自然光及熱等都可迅速破壞病毒活力。真空條件下凍干保存的病毒于4℃存活可達數年。

2 流行現狀

作為一種古老的人獸共患病，狂犬病在世界范圍內廣泛存在。2013年，世界動物衛生組織（OIE）調查顯示目前有150個國家和地區報道過狂犬病的流行，僅有部分發達國家和地區的島嶼沒有狂犬病報告，每年55000多人死于狂犬病。我國作為狂犬病高發國家，每年有上千人死于狂犬病，狂犬病發病和死亡人數居于世界第2位，僅次于印度。在 20 世紀，人類在與狂犬病的斗爭中取得了重大勝利，90 年代北美地區死于狂犬病的人數降至個位數[12]，歐洲各國 除俄羅斯外，狂犬病發病率也控制到每年 1～2個的水平，甚至有些國家多年都沒有出現過狂犬病疫情。中國在狂犬病 防治上也取得了巨大進步，雖然疫情有所反復，但總體呈現 下降趨勢，2017 年共有 502 人死于狂犬病，遠低于 2007 年的3300 人。如圖2所示。基于此，2015 年 12 月，世界衛生組織、世界動物衛生組織、聯合國糧農組織和全球狂犬病控制聯盟合作啟動了到“2030 年實現人類狂犬病零死亡” 全球框架。

圖2 近十年中國死于狂犬病人數統計

目前感染犬是我國人和動物狂犬病最主要的傳播來源，其中95%人狂犬病均是由患病犬咬傷、舔舐破損皮膚所致。病毒在體內典型的感染過程是由唾液中帶有狂犬病毒的瘋動物咬傷，使病毒從口侵入機體內。在侵入部位一般不增生，也不侵入血液，故無病毒血癥。狂犬病毒從入侵局部進入周圍神經組織內，沿著神經向心性傳遞至中樞神經系統。

我國狂犬病主要分布在人口密集的南方地區，其次為東部地區，東北和西部省份狂犬病疫情較少發生。我國流行毒株分為4個進化群，即亞洲1群、亞洲2群、北極相關群和世界群。亞洲1群分布最廣，在我國中部和東南部的22個省份流行；亞洲2群在我國東南12個省市流行；北極相關群主要在內蒙古傳播流行；世界群毒株在我國散在分布，其分支世界群草原型毒株主要在新疆和內蒙流行。新疆，狂犬病的主要傳播來源是狐貍、狼等野生動物，2012年起該省出現多起野生狐貍引發家畜狂犬病的報道，該群毒株屬于世界群草原型。

3 診斷檢測技術

3.1 病原學診斷

3.1.1 病毒分離

首先采集動物或患者死后的新鮮腦組織或甲醛固定的腦組織，腦干要包含在采集的腦組織混合物中，將采集到的病毒標本進行冷凍保存。病毒分離方法有兩種，一種是采用乳鼠體內接種法，即在乳鼠體內接種腦組織懸液，采用免疫熒光技術對乳鼠腦組織進行檢測，此方法時間較長，需25 d后方可獲得結果，且費用較高。另一種是細胞培養法，即采用鼠神經細胞瘤細胞進行細胞培養，培養1～2 d，然后采用免疫熒光技術對狂犬病毒內基氏小體進行檢測。

3.1.2 熒光抗體檢測（FAT）

熒光抗體檢測熒光抗體檢測（FAT）是OIE推薦用于檢測狂犬病病原的技術之一。FAT可用于檢測壓印片、細胞培養物及小鼠腦組織中的病原。Muhamuda等[20]報道，FAT的檢測原理是發光抗體與抗原相結合后，在紫外線照射下，用顯微鏡檢查熒光素的有無來判斷被檢樣品中的病原。FAT技術的優點是步驟簡便、耗時短、敏感性強，適用于檢測新鮮病料、甘油保存樣品及被甲醛固定的標本，病原檢出率大于99%。

3.1.3 乳鼠接種試驗

將采集的腦組織（病動物的大腦皮層、海馬或小腦、延髓等組織）勻漿懸液與含抗菌素的等滲緩沖液配成20%（W/V）溶液，待過濾后進行乳鼠腦內接種，最后利用熒光抗體實驗對死亡鼠進行狂犬病毒檢測。動物接種試驗的優點是可以收獲大量的病毒，用于毒株的保存及后續鑒定工作，缺點是這個試驗必須使用SPF動物，試驗成本高，不適用于大規模檢測工作。

3.2 血清學診斷

3.2.1 熒光抗體病毒中和試驗

熒光抗體病毒中和檢測試驗（FAVN）是將抗體血清與狂犬病病毒在體外中和，然后接種BHK-21細胞或C13細胞，測定血清抗體100%中和病毒及血清滴度在50%以上就能中和病毒時的血清稀釋度。原始的FAVN方法已被改進，目前常用的方法為96孔微量板定量法。

3.2.2 快速熒光灶抑制試驗

RFFIT是WHO狂犬病專家委員會推薦的標準方法，常用以評價RABV中和抗體的含量。抗體水平是監測中樞神經系統免疫反應的重要工具。該實驗是讓血清進行三倍系列稀釋檢測，將狂犬病毒與預先滴定過的中和進行等量混合，需在37℃溫度條件下中和1 h，然后將96孔E接種形成單位的BSR細胞，再在37℃下的CO2孵箱中培養1 d，并將其固定同時進行熒光抗體染色，最后用熒光鏡觀察并將熒光灶數記錄好，然后根據該數量計算血清抗體效價。

3.3 分子生物學診斷

該診斷方法主要是通過逆轉錄-聚合酶鏈反應直接擴增病毒株特異而保守的N基因。逆轉錄-聚合酶鏈反應有兩大特點，一是靈敏度極高，二是特異性極高；其在大規模樣品的初步篩選中是無可替代的，且檢測結果直觀，容易判定。不過其結果也會受非特異性序列變異、病毒稀釋間接性、樣品采集時間、樣品類型等影響，所以其試驗結果僅供參考，不可作為確診依據。

4 疫苗

狂犬病疫苗已經有上百年的發展歷史，法國科學家巴斯德早在1885年就制備出了世界上第一支狂犬病疫苗，首次用于人體并成功預防了狂犬病。狂犬病疫苗的研究一直是狂犬病防控技術研究中的一個最重要組成部分。狂犬病疫苗的研究主要經歷了3個階段，通過感染組織或感染雞胚等方法制備的組織疫苗，為第一代狂犬病疫苗；通過人工感染體外培養的細胞制備的弱毒疫苗或滅火疫苗，成為第二代疫苗；通過分子生物學技術制備的疫苗為第三代疫苗。

4.1 神經組織疫苗

最早的狂犬疫苗是利用動物的神經和腦組織制備的，因此稱為神經組織疫苗。1885年路易·巴斯德成功地利用神經組織疫苗挽救了一名被瘋狗嚴重咬傷的兒童。神經組織疫苗免疫同時也具有強烈的毒、副作用，后來雖然有所改進，但仍能致人癱瘓甚至死亡。WHO于1984年建議停止生產和使用這類疫苗。

4.2 禽胚組織疫苗

1956年以后又成功的利用鴨胚研制出禽胚組織疫苗，這種疫苗多數用于暴露前的免疫，產生中和抗體水平較腦組織疫苗低，偶有神經系統并發癥的發生[27]。1980年瑞士Berna廠用化學提取和區帶離心純化技術生產出一種鴨胚純化疫苗，接種后與二倍體疫苗產生的抗體水平相當，不良反應很輕，但產量較低，應用量很少。

4.3 細胞培養疫苗

20世紀60年代以后細胞培養疫苗的制備技術得到較大發展，主要有地鼠腎細胞培養疫苗、純化雞胚細胞疫苗、Vero細胞疫苗和人二倍體細胞疫苗，目前國內外廣泛應用的狂犬疫苗為這類疫苗。

5 結語

狂犬病是一種呈世界分布的自然疫源性疾病，及時準確的診斷是控制狂犬病流行的有效方式。目前，全球仍有大約150個國家或地區中有狂犬病流行，有30余個國家和地區消除了由犬類傳播給人類的狂犬病。但在中國，狂犬病仍是困擾公眾的一個公共衛生威脅。偶爾有媒體報道有個別患者注射了疫苗仍發作狂犬病，造成了一定范圍的恐慌，所以我們得重視對狂犬病疫苗的監督，研制出更有效果的更好的疫苗，正確認識狂犬病有助于控制狂犬病的傳播。