淺談非洲豬瘟實驗室檢測的注意事項

陳小麗

(三明市農業局,福建三明 365000)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，又稱非洲豬瘟疫或疣豬病。臨床以高熱、食物廢絕、皮膚和內臟器官出血、高死亡率為特征，沒有特效藥，沒有疫苗，所以一旦發現必須撲殺并無害化處理。我國將非洲豬瘟列為一類動物疫病，是烈性外來疫病，嚴重危害著全球養豬業。

非洲豬瘟緣起非洲，1921年，非洲東部的肯尼亞首次確認非洲豬瘟疫情之后，陸續蔓延至歐洲、南美洲、歐亞交界處的歐洲地區。2018年8月3日，國家參考實驗室確診沈陽市沈北新區發生中國第一例非洲豬瘟疫情。不到一年時間，非洲豬瘟疫情已經覆蓋了全中國，農業部也及時采取了各種措施來防控非洲豬瘟。而實驗室檢測成為防控非洲豬瘟疫情中一個非常重要的手段。無論是農業農村119公告強調生豬點對點調運的非洲豬瘟檢測工作，還是農業農村部關于加強屠宰環節非洲豬瘟檢測工作的通知等等都強調了實驗室非洲豬瘟病原PCR的檢測對非洲豬瘟防控的重要性。

1 非洲豬瘟樣品的采集和送檢

生豬點對點檢測主要是采集生豬的抗凝血。采用裝有抗凝劑的負壓管，前腔靜脈采集5ml的血液，顛倒混勻。如條件允許，最好每份血液樣品采集2管，以便留存充足的備份樣品。豬肉產品的調運檢測主要采集豬肉組織和豬內臟。用采樣杯采集不同部位的豬肉組織和豬脾臟、淋巴結等內臟組織。所有送檢的樣品都必須用病原專用密閉容器密封、固定，置于裝有冷卻用品的容器中迅速送檢。

2 實驗室診斷

非洲豬瘟是外來病，2018年8月第一次在中國確診發生，而且疫情來勢兇猛，傳播速度驚人。中國動物疫病預防控制中心、中國動物衛生與流行病學中心、中國獸醫藥品監察所、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所等單位共同組成評價專家，于2018年11月26日至12月19日開展了非洲豬瘟現場快速檢測試劑評價工作。農業農村廳辦公室于2019年1月份公布第一批非洲豬瘟現場快速檢測試劑評價結果的通知（農辦牧（2019）3號）。傳統的病原PCR檢測需要對樣品的核酸進行提取，快速檢測試劑均為免提取試劑盒，不需要對樣品進行核酸提取，只需要對樣品做簡單的處理便可進行擴增檢測，極大的提高了工作效率。

3 實驗室污染的控制措施

生豬點對點調運實施點對點批批檢，檢測數多，任務重。市級實驗室每天平均檢測一千份左右，且實驗室基本每天都在運行。長期大數量的檢測，嚴重威脅了實驗室的生物安全。很多實驗室經過一段時間持續的檢測后，出現了環境污染的問題。陰性對照出現特異性的擴增，導致結果無法判斷。下圖是三明市某縣獸醫實驗室做非洲豬瘟樣品時的擴增結果。

從圖片信息可知，陽性對照擴增曲線正常，陰性對照出現擴增曲線，65個未知血樣有14個樣品出現擴增曲線。追溯樣品，來源于3個養殖企業，目前該養殖企業的豬各類指標正常，沒有疑似非洲豬瘟的臨床癥狀。結合實驗室情況，該實驗室最近接收大量的非洲豬瘟生豬血液檢測樣品。由于任務繁重，人員不足等問題，該實驗室每做完一批非洲豬瘟樣品，僅對實驗室進行簡單的桌面擦拭和紫外消毒。

綜合各類因素，該實驗室先保存好樣品，然后進行一個實驗室的“大掃除”。首先，先把實驗桌面，冰箱，廢物桶等各類實驗廢棄物整理出實驗室進行無害化處理。接著用10%的次氯酸擦拭耗材包裝袋、實驗臺面、熒光定量PCR的放樣孔和其他的臺面。實驗室地面用次氯酸鈉拖洗兩遍。然后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其他表面，實驗設備如加樣器等需高壓消毒處理，最后開通風設備通風半天。

為了保證實驗人員的安全及防止有潛在傳染性樣本的散播，樣本處理操作應該在生物安全柜中進行。

此圖為實驗室徹底消毒以后，重新對65個樣品進行非洲豬瘟病原PCR檢測，結果只出現一條陽性對照擴增曲線，陰性對照未出現特異性擴增，65 個未知樣品均未出現特異性擴增。由此可見，實驗室的污染導致了前一次14個樣品的假陽性。

為了避免實驗室的再次污染，日常檢測過程中需要注意幾點。第一、實驗室要進行分區。基因擴增檢驗實驗室原則上分為三個相對獨立的工作區域：（1）標本制備區、（2）反應混合物配制區、（3）擴增產物分析區。工作區域必須有明確的標記，避免不同工作區域內的設備、物品混用。進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從標本制備區、擴增反應混合物配制區至．擴增及擴增產物分析區，避免發生交叉污染。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服，以便于鑒別。每個區域都有固定的儀器和設備，不同局域的物品不得交叉使用。第二、要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動。可通過在本區內設立正壓條件避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管，特別是質控陽性對照極易污染環境，需要最后加樣，加樣時特別小心避免氣溶膠產生引起交叉污染。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒（例如含次氯酸鈉溶液）容器內。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料（原始標本、提取中的標本與試劑的混合液等）如出現外濺，則必須分別處理并作出記錄。

非洲豬瘟實驗室檢測已經成為防控非洲豬瘟的重要工作之一，實驗室準確的診斷結果對非洲豬瘟的防控起到了重要的作用。農業部119公告里強調生豬點對點調運實行批批檢的政策，加重了各級獸醫檢測部門的工作量。檢測樣品越多，實驗室就越容易造成污染。為了避免實驗室檢測過程中假陽性或者假陰性的出現，實驗室檢測非洲豬瘟一定要規范操作。符合農業部相關的規定，檢測過程中嚴格按生物安全手冊的相關規定操作，保證能夠及時、準確的得出檢測結果以便指導生產、為疫病的防控提供科學的依據。