動態顯色法檢測玻璃酸鈉注射液中的細菌內毒素

黃慧娟 喬玉潔 張軍東

上海建華精細生物制品有限公司 上海 201611

玻璃酸鈉注射液適用于變形性膝關節病，肩關節周圍炎。玻璃酸鈉注射液注入關節腔內，可覆蓋和保護關節組織，改善潤滑功能；改善關節炎患者日常活動及關節活動范圍[1]。玻璃酸鈉注射液作為注射劑應嚴格控制樣品中的細菌內毒素含量，避免臨床使用中熱原反應的發生，。國家食品藥品監督管理局國家藥品標準-玻璃酸鈉注射液（標準號：WS1-（X-058）-2006Z-2011）中細菌內毒素應小于0.1EU/mg；而日本藥典（JP XVII）[2]中玻璃酸鈉注射液細菌內毒素的限度為應小于0.03EU/mL。為了提高產品的質量保障水平，增強國際競爭能力，本文將按照2015年版《中國藥典》四部通則1143細菌內毒素檢查法[3]建立動態顯色法檢測玻璃酸鈉注射液細菌內毒素含量的方法。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器

LKL164-03（64孔）動態試管檢測儀（湛江安度斯生物有限公司）；Eppendorf微量取液器（50～1000μl）；細菌內毒素檢查用水，無熱原試管及無熱原槍頭（湛江安度斯生物有限公司）；QL-901型漩渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BS124S分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）

1.2 藥品與試劑

動態顯色法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號1804200，靈敏度0.005～50EU/mL）；細菌內毒素檢查用水（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，批號18016003，5.0ml/支）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號150601-201885，80EU/支）；細菌內毒素工作標準品（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，批號160301，15EU/支）；玻璃酸鈉注射液（上海建華精細生物制品有限公司自制，批號1803291、1804201、1805101，規格 2.5ml：25mg）

2 方法

2.1 細菌內毒素限值（L）的確定

依據日本藥典（JP XVII）中玻璃酸鈉注射液細菌內毒素限值標準（應小于0.03EU/mL），確定本品細菌內毒素檢查限值為應小于0.03EU/mL。

2.2 標準曲線的可靠性試驗

將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解稀釋，用漩渦混勻器溶解完全后進一步進行梯度稀釋得到細菌內毒素標準品濃度分別為50，5，0.5，0.05，0.005EU/mL的標準品溶液，各取0.1ml分別加至含有0.1ml鱟試劑的反應管中，混合后插入動態試管檢測儀中，每個濃度平行3管進行檢測，并以2管細菌內毒素檢查用水作空白對照。檢測溫度為37℃±1℃，設置波長為405nm，達限值為92%，反應時間為3600s，儀器自動以細菌內毒素標準品濃度的對數（lgC）為橫坐標，反應時間的對數（lgT）為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程并計算相關系數。

2.3 最小有效稀釋濃度（C）的確定

供試品C計算公式為C=λ/L，式中L為供試品的細菌內毒素限值0.03EU/mL，λ為標準曲線上最低的內毒素濃度0.005EU/mL，得出供試品的C為0.167ml/ml。

2.4 干擾試驗

根據2015年版《中國藥典》四部通則1143細菌內毒素檢查法規定，，本試驗選擇0.5EU/mL為λm，添加至供試品中進行供試品干擾試驗。取三批玻璃酸鈉注射液各1g，精密稱定，用細菌內毒素檢查用水分別稀釋至0.167ml/ml，即為供試品溶液；同時用供試品溶液制備含有細菌內毒素濃度為0.5EU/mL的溶液為供試品陽性溶液。取細菌內毒素工作標準品1支加入細菌內毒素檢查用水1ml，置渦旋混合器上混合5分鐘，即得標準儲備溶液，用細菌內毒素檢查用水將標準儲備液梯度稀釋至5EU/mL，0.5EU/mL，0.05EU/mL，0.005EU/mL，即為細菌內毒素系列標準溶液；細菌內毒素檢查用水為陰性對照。依照“1.3.2”項下方法測定，其中細菌內毒素系列標準溶液平行3管，其他溶液平行2管。儀器自動按所得線性回歸方程分別計算出供試品溶液和供試品陽性溶液的內毒素含量并得出該試驗條件下的回收率，應在50%～200%之間。

2.5 樣品的細菌內毒素檢查

取3批樣品進行檢測，計算供試品細菌內毒素含量，以EU/mL表示，并進行樣品細菌內毒素回收率的測定。

3 結果

3.1 標準曲線的可靠性

根據2015年版《中國藥典》四部通則1143細菌內毒素檢查法規定，當陰性對照的反應時間大于標準曲線最低點反應時間，將全部數據進行線性回歸，根據線性回歸分析，標準曲線的相關系數的絕對值大于或等于0.980，各組平行試管的變異系數均小于10%，試驗方為有效。經檢測，標準曲線得到回歸方程lgT=2.7224-0.2701lgC，相關系數絕對值為0.9999，標準曲線可靠性試驗有效，試驗結果見表1。

表1 動態顯色法標準曲線可靠性試驗結果

3.2 干擾試驗結果

玻璃酸鈉注射液在稀釋至0.167ml/ml的濃度下內毒素的回收率均在50%～200%的范圍內，表明在該稀釋倍數下不存在增強或抑制的干擾作用，且測得的內毒素數據真實有效。供試品干擾試驗結果見表2。

表2 供試品干擾試驗結果

3.3 樣品中細菌內毒素檢測結果

采用上述動態顯色法對三批玻璃酸鈉注射液樣品進行細菌內毒素含量測定。標準曲線方程lgT=2.5490-0.2744lgC，相關系數為0.9985，計算樣品濃度0.167ml/ml下的細菌內毒素含量，供試品原液內毒素含量均＜0.005EU/mL，樣品濃度為0.167ml/ml，得到樣品細菌內毒素含量均＜0.03EU/mL，且試驗結果均符合有效性要求，檢驗結果符合限度要求。

4 討論

本研究通過2015年版《中國藥典》四部通則1143細菌內毒素檢查法以及參考文獻資料[4-8]，建立了動態顯色法檢測玻璃酸鈉注射液細菌內毒素含量的方法，研究結果表明玻璃酸鈉注射液在6倍稀釋濃度下的樣品溶液不存在干擾作用，檢測三批次自制樣品，結果顯示樣品細菌內毒素含量均＜0.03EU/mL，符合日本藥典（JP XVII）中玻璃酸鈉注射液細菌內毒素限值標準。動態顯色法是檢測反應混合物的吸光度或透光率達到某一預先設定的檢測值所需要的反應時間，該方法相比常用的凝膠法能夠準確的測出細菌內毒素的含量，且操作簡便，數據具有可追溯性。本研究試驗方法穩定，能準確檢測樣品中的細菌內毒素含量，可用于玻璃酸鈉注射液產品細菌內毒素含量的測定。