CACNA1A、APOE基因多態性與新疆維吾爾族人群剝脫綜合征發病的相關性研究

溫鑫，陳雪藝

剝脫綜合征 (exfoliation syndrome，XFS)是一種與年齡相關的系統性疾病,以細胞外基質中剝脫物質的沉積為特征，表現為灰白色頭皮屑樣的物質在眼部組織中堆積。沉積物可出現在眼的所有前段結構，包括晶狀體囊、虹膜、纖毛體、細帶和小梁網，但最常見的部位為瞳孔緣和晶狀體前囊[1]。1917年，林德伯格在慢性開角型青光眼的患者的瞳孔周圍首次發現并描述了這一物質，然后提出了XFS[2]的概念，人們才逐漸開始對其展開相應的研究。

剝脫綜合征在世界范圍內均可發病，但其發病情況卻不盡相同。XFS在世界范圍內好發于斯堪的納維亞半島地區[3]。在中國地區，新疆維吾爾族人群較為高發。庫車地區研究表明，60歲左右或大于60歲以上的維吾爾族人群中，XFS有2.2%的發生率；而在大于80歲的人群中，這一數字達到9.5%[4]。這充分提示了XFS發病與種族、年齡密切相關。

1 對象與方法

1.1 對象

收集2012年3月至2013年5月在新疆喀什地區、庫車地區以及新疆醫科大學第一附屬醫院確診為剝脫綜合征的維吾爾族人群作為研究組（XFS組），共216例，與研究組生活背景等相匹配并且經嚴格檢查確定無血緣關系的維吾爾族健康人群作為對照組，共297例納入本研究。所有研究對象均簽署知情同意書，并且歷經詳細的眼科檢查（視力、裂隙燈、眼壓、前房角鏡檢查、視野、間接眼底鏡等），通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的倫理審查資格。

1.2 診斷標準

XFS診斷標準[5]：（1）眼前段有典型 XFS物質存在于晶體囊，瞳孔緣出現灰白色頭皮屑樣剝脫物質。晶狀體前囊中央有密集粉塵狀灰白色膜樣小盤或周邊部有鋸齒狀或花邊樣灰白色顆粒樣混濁環帶；（2）小梁網色素沉著增多和瞳孔緣虹膜色素花邊脫失；（3）視盤和標準自動化視野檢查正常；（4）Goldman壓平眼壓計測量IOP≤21 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。

納入標準：對照組 （1）沒有異常物質聚集于眼前段或瞳孔緣；（2）眼壓≤21 mm Hg；（3）視野和視盤正常;（4）無青光眼家族史的人群；（5）生活背景與研究組相匹配且無血緣關系的維吾爾族對照組；（6）除了輕微屈光不正外沒有其他眼部疾病。XFS組（1）符合 XFS 的診斷標準；（2）維吾爾族人群；（3）同意參加臨床研究并簽署知情同意書。

排除標準：（1）其他原因引起的繼發性青光眼（葡萄膜炎、色素上皮綜合征、虹膜角膜內皮綜合征）；（2）強烈紅外線接觸史；（3）自身免疫性疾?。唬?）高血壓病等心腦血管疾??；（5）惡性腫瘤；（6）糖尿病；（7）肝炎；（8）不能配合完成本研究者。

1.3 方法

每組均取EDTA Na2抗凝的外周血5 ml，立即放入-80℃冰箱備用，用全血基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA，通過蛋白/核酸比色儀對提取的全基因組DNA進行定量和純度分析。針對rs4926244，rs429358，rs7412位點，合成其相應特異性引物進行PCR擴增，取5 μlPCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳陽性PCR產物送測序。電泳陽性PCR產物送（北京六合華大基因科技股份有限公司）ABI-PRISM3730測序儀測序分析，測序峰圖用Chromas軟件和DNAMAN軟件分析等位基因、單倍體多態性。明確新疆維吾爾族XFS患者與對照組間外周血CACNA1A基因rs4926244位點、APOE基因rs429358、rs741位點是否存在多態性，是否與新疆維吾爾族人群XFS發病相關。

1.4 統計學方法

應用SPSS 22.0統計學軟件，計量資料符合正態分布，進行方差齊性檢驗后采用兩獨立樣本的t檢驗，用均數±標準差(xˉ±s)來表示，采用 χ2檢驗比較 XFS組和對照組間基因位點的差異性，是否符合Hardy-Weinberg平衡 （Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），采用χ2檢驗，比較的參數是XFS組與對照組之間各SNPs位點的基因型。利用雙重Logistic回歸模型計算基因型及等位基因比值比（oddsratio，OR）及95%置信區間（confidence interval，CI）所有的統計分析采用雙側概率進行檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義，證明基因位點與疾病的發生具有相關性。

2 結果

2.1 一般資料

研究組共納入216例患者，對照組共納入297人。研究組患者年齡為（69.90±8.47）歲，對照組研究對象年齡為（62.46±9.94）歲，差異有統計學意義(t=9.13，P＜0.01)，在后面行基因位點分析時已用Logistic回歸矯正年齡帶來的誤差。研究組中男146例，女70例，對照組中男159人，女138人，研究組和對照組中性別差異有統計學意義 (t=10.25，P＜0.01)。

2.2 各研究SNPs位點的Hardy-Winberg(HWE)平衡

用卡方檢驗來驗證HWE平衡，XFS組CAC-NA1A基因 rs4926244及 APOE基因 rs429358、rs7412的研究組及對照組均符合HWE平衡（表1）。

表1 XFS組與對照組3個SNP位點的HWE檢驗比較

2.3 CACNA1A、APOE基因與XFS的關系

CACNA1A基因的rs4926244位點在研究組及對照組中各分型比較無統計學意義（P＞0.05），提示CACNA1A基因的rs4926244位點可能與新疆維吾爾族XFS發病無關。APOE基因的rs429358、rs7412位點在研究組及對照組中各分型比較無統計學意義（P＞0.05），提示 APOE 基因的 rs429358、rs7412 位點可能與新疆維吾爾族XFS發病無關(表2)。

為了進一步探究基因與疾病的關聯性，按照rs4926244位點、rs429358位點、rs7412位點分型結果分別建立了不同的遺傳模型，包含了Dominant(頻率低的allele為顯性)，Recessive(頻率低的allele為隱性)，Log-additive(疊加作用)。因變量代表參選人群是否患病（否=0，是=1），自變量代表顯性模型、隱性模型和加性模型等不同遺傳模型，對獲得的實驗數據進行關聯分析，結果表明：無論在年齡矯正前還是年齡矯正后，rs4926244位點、rs429358位點、rs7412位點的P值均＞0.05，差異無統計學意義。故基因多態性與XFS并無關聯（表3）。

表2 3個SNP位點在研究組和對照組中的各模型分析結果（單位：例）

表3 基因單倍體多態性與XFS的關聯性分析

3 討論

盲和視力損害是世界范圍內的共同難題，XFS是白內障、青光眼的病因之一。XFS發病隱匿，患者常并發白內障、青光眼嚴重影響視力才來就診，失去最佳治療時機而致盲，國內外已有大量文獻報道 XFS分布有明顯種族及地域特征[6-12]，患病率：0～20%，芬蘭[12]：22%，冰島[12]：29%，而格陵蘭島愛斯基摩人[8]：0，在我國漢族人群中XFS屬于少見眼病，香港報道[9]60歲以上患病率為0.4%；新加坡[9]也證實XFS在當地華人中較為少見，患病率為0.7%。

為了更好的了解XFS的病因，Tin Aung等[13]開展了GWAS研究，在日本選取了研究組1484例和對照組1188例，并在后續工作中從來自6個洲的17個國家選取了對照組6901例，研究組20727例進行Meta分析，發現了新的基因CACNA1A的rs4926244與剝脫綜合征發病的關聯性。這是自LOXL1基因以來的又一新的基因位點。

CACNA1A編碼P/Q型電壓依賴的鈣通道的α1A亞單位。鈣通道運送鈣離子穿過細胞膜，并在產生和傳送電信號中扮演重要作用。之前關于剝脫綜合征的電鏡研究表明：高濃度鈣離子與形成剝脫纖維物質直接相關。另外，原纖維蛋白利用鈣離子形成穩定的聚集[14]。我們可以假設鈣通道的改變作用可以導致鈣離子聚集的改變，這種作用也許更容易形成剝脫物質聚集[15]。關于CACNA1A基因在眼部組織的表達的信息很缺乏，我們從許多人類的眼部組織及癌細胞株中分別發現了mRNA的表達輪廓及蛋白表達。我們發現除了視神經節，CACNA1A基因的mRNA在所有眼部組織中都有所表達，例如睫狀體、虹膜、晶狀體前上皮、視神經膠質細胞、血管內皮細胞和視網膜感光細胞[16]。

APOE位于19q13.2染色體上，編碼APOE蛋白。該蛋白是一種富含精氨酸的堿性蛋白，由299個氨基酸殘基組成，相對分子質量為3,4000，含32個精氨酸和12個賴氨酸[15]。APOE的合成是由位于一個基因位點上的3個等位基因，即e2、e3、e4所控制，每個等位基因對應1個主要異構體，產生3種純合子(E2／2、E3／3、E4／4)和 3 種雜合子(E2／3、E2／4、E3／4)共6種常見的表型。在自然人群中，e3基因頻率最高，APOE E3／3 表型分布約占 70%[17-19]。 AI—Dabbagh等[20]的研究表明在沙特阿拉伯人群中，APOE可能是XFS的一個危險因子，而等位基因￡3可能起到保護作用。Yilmaz等[21]則報道APOE的等位基因e2與土耳其人群的XFS有密切聯系，XFS患者人群中￡2基因頻率約為50%。也有關于APOE和青光眼關聯性的研究，早期的研究資料主要是關于澳大利亞白人[22]、瑞典[23]、英國[24-25]等人群，日本[26]、中國[27]較少有關于這方面的報道，且研究結果并不一致。在德國和挪威的XFS患者中，APOE基因型和基因頻率與正常人群沒有明顯的區別[28-29]。

上述研究表明，CACNA1A基因的rs4926244位點及與APOE基因的rs429358、rs7412位點新疆維吾爾族XFS的發病無關，也許是樣本量還不夠大?；诹餍胁W調查卻發現XFS高發于新疆維吾爾族，而新疆維吾爾族為相對隔離群體，遺傳背景較為單一，居住相對集中和固定，是研究XFS的理想人群[30-32]。本研究中研究組和對照組樣本均來自于同一地區、同一個遺傳上相對均質的相對隔離群體，因此本研究結論是相對可信的。此外，XFS是多基因變異共同作用所致，每一個基因的單個位點變異對疾病有所影響，對于XFS的發病機制還有待于進一步研究。