芪明顆粒防治早期放射性視網膜病變的機制研究

劉愛琴 ，王倩 ，阮琳潔 ，董國軍 ，嚴然

放射性治療是腫瘤常見治療方式之一，尤其是頭頸部腫瘤，約有65%～75%的惡性腫瘤患者治療方案中包含放射性治療[1]。持續的低劑量或超過閾值的劑量會損傷眼部的葡萄膜血管、視網膜，形成放射性視網膜病變（Radioactive Retinopathy，RR），即慢性進行性、遲發性視網膜、脈絡膜和視盤的血管閉塞性疾病[2]，臨床表現以患者的視功能下降為主，對腫瘤患者的生活質量造成嚴重影響，是放療后常見致盲的原因之一。目前對視網膜病變的干預，西醫治療主要以玻璃體腔注藥[3]、視網膜激光光凝[4]、光動力療法[5]、皮質類固醇[6]、抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[7]治療等，多適用于中后期癥狀表現明顯的患者。中醫認為此病屬于“視瞻昏渺”“暴盲”等范疇，治療以益氣化瘀通絡、補益肝腎為原則，達通絡明目之效[8]。鄧永紅等[9]研究證實芪明顆粒能夠早期及時干預放射性視網膜損傷，導致視網膜的血管微循環好轉，促進視網膜出血、滲出的重吸收，從而明顯的改善視功能。研究發現內質網應激反應與RR的新生血管生成存在一定的關系，并調控低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)進一步作用VEGF的表達。因此，本實驗通過觀察芪明顆粒對早期RR大鼠模型用藥過程中病變視網膜組織形態學改變，檢測內質網應激反應相關蛋白 (C/EBP-homologous protein，CHOP)的表達，以及HIF-1α、VEGF表達情況，從而明確芪明顆粒干預RR的療效，并對其機制進行研究，為臨床治療放射性視網膜病變提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

2月齡清潔級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠75只，平均體重約200 g。飼養環境：空氣流通，室溫18～26℃，相對濕度 55%～70%，12 h晝夜交替，適應性飼養7 d后，隨機分為正常組、模型組、中藥組，共3組，各25只。

1.2 儀器與試劑

用于放射造模的 Elekta Com Pact(TM)治療器(瑞典醫科達公司生產)；眼科手術顯微鏡（蘇州六六公司）；視網膜組織切片觀察分析用顯微鏡（Olympus,Tokyo,Japan,BX53）。正常組與模型組選用0.9%氯化鈉注射液；中藥組選用芪明顆粒（成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科生產，批號：980908）。

1.3 模型制作

將大鼠按體重決定麻醉劑量，照射前模型組和中藥組均按照7%的水合氯醛5 ml/kg麻醉。麻醉方法：用左手固定住大鼠頸部，小拇指緊扣尾部，對腹部進行常規消毒，右手于右下腹部進針，向上約45°，刺入腹腔為止，等大鼠無翻正反射后，使其俯臥在放射臺上，用透明膠布固定，暴露頭上部。將放射區域調整在2 cm×2 cm范圍，將光野上界調在雙眼內眥的連線上，下界調在雙耳后的連線上，進行放射對位，利用鉛塊將放射野外的軀干部位進行遮蔽，使得口腔和鼻腔排外放射。將放射調整為SSD模式，距離100 cm，深度及等效為2 cm，吸收率80 cGy/min，照射量10 Gy/次，每次持續照射約13 min，1周進行1次照射，共3次，總劑量為30 Gy。待照射完畢后，大鼠蘇醒便立即送回到眼科實驗室，照射組分組后常規飼養。

1.4 用藥方法

各組大鼠在造模后3個月開始給藥，連續灌胃1個月。具體給藥步驟及方法如下。

正常組：灌胃劑量與中藥劑量組大鼠等容量的生理鹽水，每日1次。

模型組：灌胃劑量與中藥劑量組大鼠等容量的生理鹽水，每日1次。

中藥組：將芪明顆粒加入生理鹽水攪拌均勻，配成芪明顆粒水溶液。根據標準成人（以60 kg體重計算）的口服劑量，芪明顆粒（4.5 g，每日3次）服用劑量13.5 g/日，合算為0.225 g/kg的日用量。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠視網膜組織形態觀察 分別于用藥1個月、3個月后取其右眼行HE染色，制備視網膜消化鋪片，在不同的倍數下觀察視網膜血管走行、分布，以及周細胞、內皮細胞形態特點。

1.5.2 大鼠視網膜CHOP、HIF-1α、VEGF表達檢測分別于用藥1個月、3個月后取各組大鼠左眼進行免疫組化染色，統計CHOP、HIF-1α、VEGF的表達情況。具體免疫組化染色方法：（1）取石蠟切片于烤片機烘烤 2～3 h，放置 60℃烤箱 18 h；（2）用吹風機吹至產生蠟液，采用二甲苯脫蠟20 min，并在無水酒精與蒸餾水配置的梯度乙醇中脫水；（3）將配置好的枸櫞酸緩沖液于高壓鍋中煮沸后，將切片置入，高壓煮沸加熱2～3 min，取出切片自然冷卻至室溫；（4）切片放置3%過氧化氫罐中10 min，取出用自來水沖洗多次，最后一次用PBS沖洗；（5）50 ul山羊血清封閉 10 min，滴加一抗（1：40），放置 4℃冰箱14 h；（6）PBS 沖洗 3 次，每次約 3～5 min；擦拭組織周圍水分，加入Envision二抗，放置37℃孵箱中25 min；（7）PBS 沖洗 3 次，每次約 3～5 min；滴加 DAB顯色劑，顯色后反復自來水清洗；（8）切片置入蘇木精罐復染5 min，反復自來水清洗；（9）置入1%鹽酸酒精數秒后，用涼清水沖洗；置入氨水罐數秒后，用自來水沖洗；（10）取梯度乙醇對切片脫水，利用二甲苯透明，用樹脂封好組織切片。

圖1 各組早期RR視網膜細胞組織形態（HE ×200）。 1A 用藥1個月后正常組；1B 用藥1個月后模型組；1C 用藥 1個月后中藥組；1D 用藥3個月后正常組；1E 用藥3個月后模型組；1F 用藥 3個月后中藥組

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0軟件進行分析，對比分析視網膜各層細胞、組織變化。多組數據采用單因素方差分析方法，兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD）。數據結果用平均值±標準差（xˉ±s）表示，以 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芪明顆粒作用于早期RR視網膜細胞組織形態

用藥1個月后，模型組視網膜顯著變薄，主要為外核層、內核層，節細胞層細胞組織排列紊亂水腫，無色素層細胞，余各層細胞排列稀疏。與模型組相比較，中藥組節細胞層細胞組織更整齊致密，外核層、內核層層數及形態比較完整，水腫減輕，無明顯水腫及空泡（圖 1A-1C）。

用藥3個月后，模型組視網膜內界膜、視神經纖維層的毛細血管增生，擴張，纖維不同程度增生。與模型組比，中藥組節細胞層細胞組織顯著整齊，外核層、內核層形態比較完整（圖1D-1F）。

2.2 芪明顆粒影響早期RR視網膜CHOP蛋白、HIF-1α蛋白和VEGF表達的影響

CHOP蛋白表達：用藥1個月、3個月后，與正常組相比，模型組、中藥組表達均增多。與模型組比較，中藥組表達均減少，1個月后兩組含量比較（t=2.563，P=0.028），3 個月后 2 組含量比較 （t=9.513，P=0.000）均具有統計學意義。（表1、圖2A-2F）

HIF-1α蛋白表達：用藥1、3個月后，與正常組相比，模型組、中藥組表達均增多。與模型組比較，中藥組表達均減少，1個月后2組含量比較 （t=7.873，P=0.000），3 個月后 2 組含量比較（t=7.412，P=0.000）均具有統計學意義。（表1、圖3A-3F）

VEGF蛋白表達：用藥1、3個月后，與正常組相比，模型組、中藥組表達均增多。與模型組比較，中藥組表達均減少，1個月后兩組含量比較 （t=4.072，P=0.002），3 個月后兩組含量比較 （t=11.986，P=0.000）均具有統計學意義。（表1、圖4A-4F）

表1 各組早期RR視網膜CHOP蛋白、HIF-1α蛋白和VEGF平均光密度值比較（xˉ±s，n=6）

圖2 各組視網膜CHOP免疫組化染色（×200）。 2A用藥1個月后正常組；2B用藥1個月后模型組；2C用藥1個月后中藥組，中藥組CHOP陽性表達低于模型組；2D 用藥3個月后正常組；2E 用藥3個月后模型組；2F 用藥3個月后中藥組，中藥組CHOP陽性表達低于模型組，與正常組相近。CHOP蛋白存在以節細胞胞漿為主的視網膜各層細胞胞漿中，陽性胞漿呈棕黃色、黃色。CHOP：內質網應激反應相關蛋白

圖3 各組視網膜HIF-1α免疫組化染色（×200）。 3A用藥1個月后正常組；3B用藥1個月后模型組；3C用藥1個月后中藥組，中藥組較模型組HIF-1α陽性表達低，與正常組相近；3D用藥3個月后正常組；3E用藥3個月后模型組；3F用藥3個月后中藥組，中藥組較模型組HIF-1α陽性表達明顯低，與正常組更近。HIF-1α蛋白存在以節細胞胞漿為主的視網膜各層細胞胞漿中，陽性胞漿呈棕黃色、黃色。 HIF-1α：低氧誘導因子-1α

圖4 各組視網膜VEGF免疫組化染色（×200）。4A 用藥1個月后正常組；4B 用藥1個月后模型組；4C 用藥1個月后中藥組，中藥組較模型組VEGF陽性表達低，與正常組相近；4D 用藥3個月后正常組；4E 用藥3個月后模型組；4F 用藥3個月后中藥組，中藥組較模型組VEGF陽性表達明顯低，與正常組更近。VEGF蛋白存在以節細胞胞漿為主的視網膜各層細胞胞漿中，陽性胞漿呈棕黃色、黃色。VEGF：血管內皮生長因子

3 討論

超閾值劑量或持續低劑量的放射線照射對眼部造成的視力影響，主要由于眼底毛細血管的周細胞的損傷、內皮細胞的受損、喪失，毛細血管管壁變性增厚導致血管狹窄阻塞，微循環障礙，從而引發視網膜缺血、缺氧，激發內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，誘導氧化反應，調控下游CHOP蛋白高表達，進而誘導細胞凋亡[10]。VEGF是缺血、缺氧的條件下視網膜新生血管生成的關鍵因子，可迅速提高微血管的通透性，促進血漿蛋白大量分泌，導致血管滲漏；同時促進內皮細胞在有絲分裂過程中死亡，難以補償丟失的細胞，誘發新的血管腔形成，造成血-視網膜屏障，繼而血管內液體外漏，導致視網膜水腫或淺脫離，長期的水腫最終出現神經元變性壞死、視功能下降[11]。HIF-1α作為低氧誘導因子，在缺氧條件下可穩定VEGF的活性，加速新生血管的發生發展[12-13]。目前對于早期放射性視網膜病變的干預，西醫治療并無明確優勢。

芪明顆粒因其具有多靶點直接促進癌細胞凋亡，抑制腫瘤血管增生等作用，在腫瘤輔助治療領域具有巨大潛力[14]。現代研究證明黃芪可通過清除活性氧，進而保護視網膜細胞組織的作用；枸杞多糖的抗氧化作用可對視網膜神經節細胞起保護作用[15]，決明子可提高乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的含量，以產生豐富的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）為機體功能，擴張末梢血管，改善視神經的血液循環[16]，水蛭可降低HIF-1α介導的VEGF mRNA表達，抑制新生血管的生成，改善微環境缺血、缺氧狀態，從而達到抗腫瘤的作用[17]。此外，中醫認為放射線屬火熱毒邪，直中目系，灼傷目中陰血、津液，則目絡失養，故RR早期病機特點可概括為火熱傷津，氣陰兩虛，當以益氣養陰通絡為要，且目為肝竅，瞳神屬腎，肝腎精血虧損則無以滋養目竅，故芪明顆粒益氣生津，滋養肝腎，通絡明目之功效符合早期RR的治法。本實驗發現用藥1個月、3個月后，視網膜組織細胞水腫顯著減輕，細胞形態、排列均有所改善，隨著用藥時間延長，CHOP、HIF-1α、VEGF等表達逐漸下降向正常靠近。因此我們證實芪明顆粒可通過抑制CHOP蛋白的表達，干預內質網應激反應，緩解視網膜水腫，恢復視網膜細胞組織形態，同時調控HIF-1α降低VEGF，抑制了新生血管的生成及發展，最終改善早期放射性視網膜病變。而放射性視網膜病變的發病機制較為復雜，本實驗只證明內質網應激反應引起新生血管生成可能是其發病機制之一，因此芪明顆粒干預早期放射性視網膜病變機制還有待進一步研究。