成骨生長(zhǎng)肽衍生物抗去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松作用的實(shí)驗(yàn)研究

程露楊 李梅 李璇 丁海峰 張一娜 金迪 劉興漢 劉蕾

[摘要] 目的 通過(guò)建立去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型來(lái)研究成骨生長(zhǎng)肽衍生物對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的防治作用。方法 選取3月齡未交配雌性健康SD大鼠48只，按體重隨機(jī)分為6組，其中5組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，建立骨質(zhì)疏松模型，1組行假手術(shù)，給藥組分別給予一定劑量的ALEN、OPG、OPG1、OPG2。給藥12周后，測(cè)定骨密度，血清中的鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素。 結(jié)果 模型組與假手術(shù)組比較，骨密度明顯降低（P<0.05）;各給藥組及模型組與S組比較，骨密度降低（P<0.05），OGP1組與OGP2組比較，骨密度增加（P<0.05）;模型組與假手術(shù)組比較，堿性磷酸酶活性明顯升高（P<0.05）;治療組與模型組比較，堿性磷酸酶活性明顯降低（P<0.05）;與假手術(shù)組比較，其他各組骨鈣素活性高（P<0.05）;其他治療組分別與阿倫磷酸鈉治療組比較，血清鈣濃度升高（P<0.05）;各治療組分別與模型組比較，血清磷濃度增高（P<0.05）。 結(jié)論 成骨生長(zhǎng)肽及其衍生物對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松具有治療作用，其中OGPA1對(duì)抗去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用較好。

[關(guān)鍵詞] 骨質(zhì)疏松癥;成骨生長(zhǎng)肽;去卵巢;阿倫磷酸鈉;骨密度

[中圖分類(lèi)號(hào)] R58? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）16-0038-03

[Abstract] Objective To study the preventive and therapeutic effects of anti-osteoporosis of osteogenic growth peptide in ovariectomized rats by establishing osteoporosis model in ovariectomized rats. Methods A total of 48 3-month-old unmated female healthy SD rats were selected and randomly divided into 6 groups according to body weight. Five groups underwent bilateral ovariectomy to establish osteoporosis model. One group underwent sham operation. The drug-administered groups were given a certain dose of ALEN， OPG， OPG1， OPG2， respectively. After 12 weeks of administration， bone density， calcium， phosphorus， alkaline phosphatase， and osteocalcin in serum were measured. Results The bone density decreased significantly in the model group compared with that of the sham operation group（P<0.05）. The bone mineral density decreased in each drug-administered group and the model group compared with that of the S group （P<0.05）. The OGP1 group showed an increase in bone density compared with OGP2 group（P<0.05）. Compared with that of the sham operation group， the alkaline phosphatase activity was significantly increased in the model group （P<0.05）. The alkaline phosphatase activity was significantly lower in the treatment group than that of the model group （P<0.05）. Compared with that of the sham operation group， the activity of osteocalcin was higher in other groups（P<0.05）. The serum calcium concentration was higher in the other treatment groups than that in the alendronate treatment group（P<0.05）. The serum phosphorus concentration was increased in each treatment group compared with that of the model group（P<0.05）. Conclusion Osteogenic growth peptide and its derivatives have therapeutic effects on osteoporosis in ovariectomized rats. And OGPA1 has a better effect on osteoporosis in ovariectomized rats.

[Key words] Osteoporosis; Osteogenic growth peptide; Ovariectomy; Alendronate; Bone mineral density

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）被世界衛(wèi)生組織列為中老年人三大疾病之一，在常見(jiàn)病中位居第6位[1，2]，引起了全世界的重視。探討如何早期發(fā)現(xiàn)并有效防治骨質(zhì)疏松癥，研究治療骨質(zhì)疏松安全有效的藥物對(duì)于減輕國(guó)家和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、提高人民的生活質(zhì)量有著重要的意義。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物分為促進(jìn)成骨和抑制破骨兩大類(lèi)，其中成骨生長(zhǎng)肽在促進(jìn)骨形成方面有著重要的作用，國(guó)內(nèi)外很多專(zhuān)家學(xué)者致力于開(kāi)發(fā)具有雙重及多重作用的抗骨質(zhì)疏松藥物，在成骨生長(zhǎng)肽結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行加工修飾[3，4]，得到眾多衍生物，對(duì)骨質(zhì)疏松的防治作用具有重要的研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

未交配雌性SD大鼠，3月齡，體重230～290 g。購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物中心，SPF級(jí)，動(dòng)物合格證：SCXK（黑）2013-001。

大鼠48只，按體重隨機(jī)分為6組，其中5組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，建立骨質(zhì)疏松模型，1組行假手術(shù)，分別為：①模型組（M組），術(shù)后12周后給予磷酸鹽緩沖液每日腹腔注射;②阿倫磷酸鈉治療組（ALEN 治療組），術(shù)后12周后給予ALEN 100 μg/kg每日腹腔皮下注射;③假手術(shù)組（S組），術(shù)后12周后給予磷酸鹽緩沖液每日腹腔注射;④成骨生長(zhǎng)肽治療組（OGP治療組），術(shù)后12周后給予OGP 0.5 μg/kg每日腹腔注射;⑤成骨生長(zhǎng)肽衍生物1治療組（OGPA1治療組），術(shù)后12周后給予OGPA1 0.5 μg/kg每日腹腔注射;⑥成骨生長(zhǎng)肽衍生物2治療組（OGPA2治療組）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

OGP及OGP衍生物（OGPA1、OGPA2）由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生化教研室提供，10%水合氯醛溶液（哈醫(yī)大二院實(shí)驗(yàn)中心），青霉素（哈藥三精），PBS（嘉茂生物），ALEN（西安丹頁(yè)），骨鈣素試劑盒（上海西唐）。

1.3 OVX模型制備

各組動(dòng)物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，除 SHAM組外其余各組大鼠均行OVX，SHAM組以同樣方式找到卵巢后切除卵巢周?chē)窘M織，卵巢不予切除即分層縫合。

1.4 標(biāo)本收集與處理

給藥12周后，大鼠稱(chēng)重，腹主動(dòng)脈放血處死，血液室溫靜置4 h后1000 r/min離心15 min，分離血清，-20℃保存，備作血清骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)檢測(cè);分離左側(cè)脛骨，盡量去除肌肉及筋膜，分離第1～4腰椎即L1～4，注意保護(hù)橫突及棘突，骨標(biāo)本包裹于生理鹽水浸透的紗布中，-20℃保存，備作骨密度測(cè)量。

1.5 檢測(cè)方法

在VIATLAB Micro-Ⅱ半自動(dòng)生化分析儀上采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)血清鈣、磷、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素濃度。雙能X線骨密度儀（美國(guó)Lunar）小動(dòng)物軟件測(cè)定BMD。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布變量，滿(mǎn)足齊性行方差分析、協(xié)方差分析，組間比較采用SNK法或LSD法;方差不齊時(shí)，行變量變換或用Dunnetts T3法。非正態(tài)分布變量采用非參數(shù)檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血Ca、P水平比較

見(jiàn)表1。其他治療組分別與A組比較，Ca 濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;各治療組分別與M組比較，P濃度增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 各組大鼠血ALP、OC水平比較

見(jiàn)表2。各組大鼠血ALP、OC水平分別與S組比較，OC活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與M組、A組、OGP2組、OGP組比較，OGP1組 OC活性升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與M組比較，OGP1組、A組、OGP2組、OGP組ALP活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;M組與S組比較，ALP活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 各組大鼠脛骨BMD比較

見(jiàn)表3。各組分別與S組比較，各組骨密度均低于假手術(shù)組（S組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;OGP1組與其他手術(shù)組比較，骨密度高于其他手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

絕經(jīng)后OP是由于絕經(jīng)后雌激素分泌明顯減少，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活躍導(dǎo)致骨吸收大于骨形成的OP。雌性大鼠去勢(shì)模型，作用因素單一，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，形成機(jī)制與人類(lèi)Ⅰ型OP發(fā)病機(jī)制相似，結(jié)果穩(wěn)定，已被普遍接受。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選用去勢(shì)雌性大鼠作為OGP及其衍生物防治OP的動(dòng)物模型，大鼠自去勢(shì)術(shù)后12周開(kāi)始給予各種干預(yù)因素，用以觀察對(duì)OP的治療效果。OP模型組BMD 低于假性手術(shù)組，差異有顯著意義，說(shuō)明動(dòng)物模型復(fù)制成功[5，6]。

本研究發(fā)現(xiàn)與ALEN組比較，其余治療組血清Ca濃度增高，與模型組比較，治療組P水平均增高。提示成骨生長(zhǎng)肽及其衍生物可以提高血中鈣磷含量，促進(jìn)骨形成。

骨轉(zhuǎn)換是OC[7]不斷吸收舊骨和成骨細(xì)胞不斷形成新骨的過(guò)程，該過(guò)程也稱(chēng)骨重建。破骨細(xì)胞活動(dòng)所降解的骨基質(zhì)成分片段，和成骨細(xì)胞形成新骨釋放的物質(zhì)進(jìn)入血液和尿中，構(gòu)成了骨吸收指標(biāo)和骨形成指標(biāo)[8，9]。檢測(cè)骨形成的常用指標(biāo)之一是血清總ALP，血清ALP升高是骨轉(zhuǎn)換增加的結(jié)果。血清OC水平與骨的更新速度密切相關(guān)[10]，是反映骨形成的特異性標(biāo)志[11，12]。體內(nèi)、外研究表明，OGP具有促進(jìn)骨形成的作用，其衍生物是否保留了這種作用，本實(shí)驗(yàn)選用血清骨形成標(biāo)志ALP和OC來(lái)觀察OGP衍生物（OGP1和OGP2）促進(jìn)骨形成的作用。術(shù)后12周，治療組血清ALP活性較假手術(shù)組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明成骨生長(zhǎng)肽及其衍生物能顯著降低ALP的活性，讓骨形成多于骨吸收，骨量保持平衡而不丟失;血清OC水平與S組有顯著升高，顯示成骨活躍。以上改變提示OGP衍生物對(duì)OVX大鼠的骨形成具有一定的刺激作用。

目前OP診斷主要依據(jù)BMD測(cè)定[13]，對(duì)骨質(zhì)疏松的早期診斷、骨折風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)和防治措施的評(píng)估均有重要意義。本實(shí)驗(yàn)選用DEXA觀察OVX及OGP衍生物對(duì)大鼠離體BMD的影響。BMD測(cè)量結(jié)果顯示：與 OGP2組比較，OGP1組BMD增加，說(shuō)明OGP1增加OVX大鼠BMD較OGP2好。

在免疫研究中[14]，Estrogen缺乏時(shí)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、RANKL表達(dá)增加，T細(xì)胞增多，TNF、IL-1產(chǎn)生增多，OC分化增殖增多，生存期延長(zhǎng)，骨吸收增強(qiáng)，同時(shí)OB凋亡增多，骨形成不足以代償骨吸收，使骨量減少，骨小梁變細(xì)，小梁間隙增寬，發(fā)生骨質(zhì)疏松[15]。B淋巴細(xì)胞在PMOP中的作用在衰老和Estrogen缺乏中B細(xì)胞的改變是有證據(jù)可查的，但在OP中卻知之甚少。近年大量證據(jù)表明其與骨代謝之間的關(guān)系密切。B淋巴細(xì)胞的改變可能在一定程度上增加了骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率和病死率。本實(shí)驗(yàn)加入增加免疫成分的成骨生長(zhǎng)肽衍生物具有較好的抗骨質(zhì)疏松作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制可能為在原有OGP促進(jìn)骨形成的基礎(chǔ)上同時(shí)能夠增強(qiáng)免疫，使OVX大鼠具有良好的免疫狀態(tài)，延緩了骨流失的進(jìn)程。

綜上所述，重組人成骨生長(zhǎng)肽衍生物（OGP1、OGP2）可有效地防止卵巢切除大鼠的骨丟失，使骨在建量呈平衡狀態(tài)，從而有效地阻止骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展，是臨床上治療婦女絕經(jīng)或卵巢切除后形成的骨質(zhì)疏松癥很有潛力的藥物。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Mitchell PJ. Best practices in secondary fracture prevention： fracture liaison services[J]. Curr Osteoporos Rep，2013，11（1）：52-60.

[2] 丁超，孫強(qiáng). 老年性骨質(zhì)疏松癥相關(guān)問(wèn)題研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2016，22（3）：372-375.

[3] Policastro GM，Becker ML. Osteogenic growth peptide and its use as a bio-conjugate in regenerative medicine application[J]. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobio-technol，2016，8（3）：449-464.

[4] Hoff BA，Kozloff KM，Boes JL. Parametric response mapping of CT images provides early detection of local bone loss in a rat model of osteoporosis[J]. Bone，2012，51（1）：78-84.

[5] Garcia-Martin A，Reyes-Garcia R，Avila-Rubio V，et al. Osteocalcin：A link between bone homeostasis and energy metabolism[J]. Endocrinol Nutr，2013，60（5）：260-263.

[6] Jagtap VR，Ganu JV，Nagane NS. BMD and Serum Intact Osteocalcin in Postmenopausal Osteoporosis Women[J]. Indian J Clin Biochem，2011，26（1）：70-73.

[7] Xiong J，O'Brien CA. Osteocyte RANKL：new insights into the control of bone remodeling[J]. Bone Miner Res，2012，27（3）：499-505.

[8] Orozco C，Maalouf NM. Safety of bisphosphonates[J]. Rheum Dis Clin North Am，2012，38（4）：681-705.

[9] Benton MJ，White A. Osteoporosis：recommendations for resistance exercise and supplementation with calcium and vitamin D to promote bone health[J]. Community Health Nurs，2006，23（4）：201-211.

[10] D'Amelio P，Isaia GC. The use of raloxifene in osteoporosis treatment[J]. Expert Opin Pharmacother，2013，14（7）：949-956.

[11] Wei QS，Huang L，Chen XH，et al. Effect of whole body vibration therapy on circulating serotonin levels in an ovariectomized rat model of osteoporosis[J]. Iran J Basic Med，2014，17（1）：62-68.

[12] Hegde S，Raghavan S. A skin-depth analysis of integrins：role of the integrin network in health and disease[J]. Cell Commun Adhes，2013，20（6）：155-169.

[13] Hu HM，Yang L，Wang Z，et al. Overexpression of integrin a2 promotes osteogenic differentiation of hBMSCs from senile osteoporosis through the ERK pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol，2013，6（5）：841-852.

[14] Zhao J，Tang H，Wang J，et al. Local treatment of osteoporosis with alendronate-loaded calcium phosphate cement[J]. Chin Med J，2014，127（22）：3906-3914.

[15] Hansen S，Hauge EM，Beck Jensen JE，et al. Differing effects of PTH 1-34，PTH 1-84，and zoledronic acid on bone microarchitecture and estimated strength in postmenopausal women with osteoporosis：An 18-month open-labeled observational study using HR-pQCT[J]. Bone Miner Res，2013，28（4）：736-745.

（收稿日期：2019-03-08）