QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物

黃思聰 龍敏儀

摘 要：采用QuEChERS技術提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺，建立液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）同時測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的檢測方法。結果表明：在0.1～50.0 ng/mL范圍內，酰胺醇類抗生素及其代謝物質量濃度與其質譜響應值呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999 1;檢出限為0.007 5～0.003 0 μg/kg，定量限為0.025～0.100 μg/kg;加標回收率為94.3%～97.9%，相對標準偏差為0.8%～3.7%。

關鍵詞：酰胺醇類抗生素;液相色譜-串聯質譜法;QuEChERS;牛蛙肉

Abstract： A quick， easy， cheap， effective， rugged and safe （QuEChER） extraction procedure followed by a liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） assay was established for the simultaneous determination of amphenicol antibiotics （chloramphenicol， thiabendazole and florfenicol） and the florfenicol metabolite florfenicol amine （FFA） in bullfrog meat. The results showed that there was a good linear relationship between the mass spectrometric response and concentrations of all analytes in the range from 0.1 to 50.0 ng/mL with correlation coefficients all greater than 0.999 1. The limits of detection and quantitation were in the range from 0.007 5 to 0.003 0 μg/kg and from 0.025 to0.100 μg/kg， respectively. The recoveries from spiked samples were in the range from 94.3% to 97.9%， with relative standard deviation of 0.8% to 3.7%.Keywords： amphenicol antibiotics; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; QuEChERS; bullfrog meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190428-091

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）06-0039-05

引文格式：

黃思聰， 龍敏儀. QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物[J]. 肉類研究， 2019， 33（6）： 39-43. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190428-091.? ? http：//www.rlyj.net.cnHUANG Sicong， LONG Minyi. Determination of amphenicol antibiotics and metabolite residues in bullfrog meat by QuEChERS-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2019， 33（6）： 39-43. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190428-091.? ? http：//www.rlyj.net.cn

牛蛙（Rana catesbiana Shaw），俗名美國水蛙，是一種經濟價值較高的大型食用蛙[1-2]，原產于北美洲和墨西哥[3-4]，因個體碩大、生長快、產量高，且肉質細嫩、味道鮮美、營養豐富，具有滋補解毒功效，已成為世界各大洲養殖的主要食用蛙種[5-7]。但牛蛙在養殖過程中易發生病毒性、細菌性、真菌性等疾病，部分養殖場為追求利益而添加大量具有廣譜抗菌功效的氯霉素（chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）和氟苯尼考（florfenicol，FF）等酰胺醇類抗生素[8-9]，但若這些抗生素使用不當會殘留在牛蛙肉中，危害消費者的健康。毒理學研究表明，CAP可引起再生障礙性貧血和粒狀白細胞缺乏癥等疾病，美國、中國規定在動物食品中CAP不得檢出;TAP不易引起再生障礙性貧血，但可抑制紅細胞、白細胞和血小板的生成[10-12];FF為CAP和TAP的替代藥物，既克服了易產生耐藥性和造成再生障礙性貧血的缺陷，又具有較強的抗菌活性，且具有抗菌譜廣、吸收好、生物利用度高等特點，但FF具有一定的胚胎毒性，美國[12]、歐盟[13]、中國[14-16]均對TAP和FF的殘留量作了限量規定。因此，有必要建立牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的檢測方法。

目前，酰胺醇類抗生素的檢測方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[17]、液相色譜法（liquid chromatography，LC）[18]、氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[19]和液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[20-22]，但其中GC和HPLC無法提供目標物的結構信息，靈敏度不高;GC-MS因衍生化處理樣品前處理繁瑣;LC-MS/MS具有分離能力強、靈敏度高等特點，且操作簡便，適合低殘留多組分同時測定[23-24]。QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）是一種快速的樣品前處理技術，具有回收率高、準確度高、分析速度快等特點，QuEChERS-LC-MS/MS已用于水產品和畜禽產品中農藥、獸藥殘留檢測[25-26]。本研究采用QuEChERS技術提取凈化牛蛙肉中的CAP、TAP、FF及FF代謝物氟苯尼考胺（florfenicol amine，FFA），建立LC-MS/MS法同時測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CAP、TAP、FF、FFA標準物質（純度均大于99%）? ?德國Dr.Ehrenstorfer公司;N-丙基乙二胺（分析純）美國CNW公司;氯化鈉、無水硫酸鎂（均為分析純）? ?天津龍騰化工有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-MS 8050高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀、AUW220D電子分析天平 日本島津株式會社;JJ-2B勻漿機 江蘇常州金壇區西城基銘實驗儀器廠;VORTEX旋渦混合器 上海達姆實業有限公司;Scientz-800 CQ超聲波提取振蕩反應器 寧波新芝生物科技股份有限公司;Allegra X-22R高速冷凍離心機 德國Beckman公司;Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司;TTL-DC氮吹儀 北京同泰聯科技發展有限公司;中性氧化鋁柱（規格500 mg/6 mL） 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

精密稱取粉碎混勻5.0 g牛蛙肉樣品置于50 mL離心管中，依次加入純乙腈10 mL、無水硫酸鎂3 g、氯化鈉2 g和乙二胺-N-丙基硅烷（ethylenediamine-N-propyl silane，PSA）150 mg，渦旋振蕩1 min，超聲振蕩提取10 min（頻率40 kHz，功率800 W），10 000 r/min離心5 min;上清液經中性氧化鋁柱凈化，用3 mL乙腈淋洗，收集流出液，45 ℃氮吹近干，用乙腈定容至1 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液供LC-MS/MS測定。

1.3.2 溶液配制

標準儲備液：準確稱取酰胺醇類抗生素及其代謝物標準品各10 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成質量濃度為100 μg/mL的標準儲備液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱（100 mm×2.1 mm，2.0 ?m）;流動相A為乙腈，流動相B為純水;流速0.3 mL/min;進樣量10.0 μL;柱溫40 ℃。梯度洗脫程序：0～1 min，20%流動相A;1～2 min，20%～60%流動相A;2～3 min，60%～95%流動相A;3～8 min，95%流動相A;8～8.1 min，95%～20%流動相A;8.1～10 min，20%流動相A。

1.3.4 質譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），負離子掃描;掃描模式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）;碰撞氣：氬氣，純度>99.99%;加熱氣：氮氣，流速10 mL/min;霧化氣：氮氣，流速3 mL/min;干燥氣：氮氣，流速10 mL/min;接口溫度300 ℃;脫溶劑管溫度250 ℃;加熱模塊溫度400 ℃。

1.4 數據處理

每組實驗重復6 次，結果表示為平均值，采用SPSS 16.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

將1.0 μg/mL酰胺醇類抗生素單標以在線流動注射方式進樣。由于酰胺醇類抗生素結構式中含有氟、氯、羥基等官能團，在ESI源負離子模式下可產生帶負電荷的分子離子峰[M-H]-，故選擇負離子掃描模式，在50～500 m/z范圍內進行母離子掃描;通過自動優化模式，找出豐度較強的碎片離子，選擇豐度最強的碎片離子為定量離子，優化后的碰撞能量、錐孔電壓等參數如表1所示。

2.2 色譜柱的選擇

以酰胺醇類抗生素及其代謝物的峰面積和分離度為指標，分析Diamonsil C18、Agilent Zorbax SB C18、Waters X-Bridge C18、Shim-pack ODS C18和Shim-pack GIST C18等不同色譜柱對牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的分離效果。結果表明：在相同流動相條件下，Shim-pack GIST C18色譜柱可有效分離酰胺醇類抗生素及其代謝物，更適合分析各目標物;采用粒徑（2.0 ?m）和內徑（2.1 mm）相同的Shim-pack GIST C18色譜柱，50 mm柱用時短，但不能保證目標物均有良好的峰形，而100 mm柱用時較短，且各目標物峰形尖銳、對稱，酰胺醇類抗生素及其代謝物的提取離子總離子流圖如圖1所示。酰胺醇類抗生素單標質量濃度10.0 ng/mL。

2.3 流動相的選擇

采用Shim-pack GIST C18柱（100 mm×2.1 mm，2.0 ?m）作為分析柱，考察甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-10 mmol/L乙酸銨、乙腈-10 mmol/L乙酸銨等流動相對酰胺醇類抗生素及其代謝物的分離效果及其質譜響應情況。結果表明：在ESI源負離子模式下，水相采用純水比采用0.1%甲酸或10 mmol/L乙酸銨更容易使酰胺醇類抗生素及其代謝物電離形成帶負電荷的分子離子峰[M-H]-，且峰形良好;有機相采用乙腈比采用甲醇具有更好的分離效果和靈敏度;采用乙腈-水為流動相時，酰胺醇類抗生素及其代謝物的質譜響應值較高，且經梯度洗脫后可有效分離

2.4 QuEChERS提取溶劑的選擇

根據酰胺醇類抗生素及其代謝物的極性，結合QuEChERS前處理方法，選擇乙腈、酸化乙腈（0.1%鹽酸）、二氯甲烷和乙酸乙酯作為提取溶劑，通過空白牛蛙肉加標回收實驗進行提取效果的比較。結果表明：乙腈和酸化乙腈對酰胺醇類抗生素及其代謝物的提取效果最好，提取回收率為86.3%～98.6%，這可能是由于牛蛙肉中脂肪和蛋白質含量高，乙腈和酸化乙腈沉淀蛋白質和提取能力比較強，結合QuEChERS方法（無水硫酸鎂脫水、PSA吸附糖類、脂肪酸等有機酸及色素）與固相萃取凈化（中性氧化鋁柱吸附極性物質和除脂）可有效去除蛋白質和脂肪，但酸化乙腈提取物中殘留的酸會對酰胺醇類抗生素的質譜檢測產生干擾，重現性不理想;乙酸乙酯對酰胺醇類抗生素的提取效果較好，但對FFA提取效果較差，提取回收率約為82.7%;二氯甲烷對目標物的提取效果較好，但二氯甲烷提取物中脂肪和蛋白質較多，影響后續凈化，且耗時。因此選擇乙腈作為提取溶劑。

2.5 基質效應的消除

為消除LC-MS/MS法測定牛蛙基質中酰胺醇類抗生素及其代謝物的基質效應，采用標準添加法分析純乙腈和不含目標物的空白牛蛙樣品中的基質效應（matrix effect，ME）[20]。

由表2可知：在純乙腈和不含目標物的空白牛蛙樣品2 種基質中分別加入10、250、500 μg/kg酰胺醇類抗生素及其代謝物標準溶液，按上述QuEChERS-LC-MS/MS法測定目標物質譜響應強度，重復測定6 次，計算所得ME值為2.4%～5.3%，說明采用QuEChERS-LC-MS/MS法測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物時不存在基質干擾。

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

依次配制質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、10.0、50.0 ng/mL的酰胺醇類抗生素及其代謝物標準溶液，按上述LC-MS/MS法進行測定，以目標物質量濃度為橫坐標（x），質譜響應值為縱坐標（y），繪制標準曲線。

由表3可知：在0.1～50.0 ng/mL范圍內，酰胺醇類抗生素及其代謝物質量濃度與其質譜響應值呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999 1。采用國際純粹與應用化學聯合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）推薦的方法，對11 份不含目標物的空白牛蛙樣品進行加標測定，以3 倍信噪比（RS/N=3）為方法檢出限，以10 倍信噪比（RS/N=10）為方法定量限，得酰胺醇類抗生素及其代謝物的檢出限為0.007 5～0.030 0 μg/kg，定量限為0.025～0.100 μg/kg。

2.7 加標回收率和精密度

在不含目標物的空白牛蛙樣品中分別加入0.1、25.0、50.0 μg/kg酰胺醇類抗生素及其代謝物標準溶液，按上述LC-MS/MS法進行測定，每個添加水平測定6 次，計算回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表4可知：在0.1～50.0 μg/kg加標范圍內，酰胺醇類抗生素及其代謝物的平均加標回收率為94.3%～97.9%，RSD為0.8%～3.7%，符合方法學的要求，表明該法準確度高、精密度好。

2.8 實際樣品分析

按本研究所建QuEChERS-LC-MS/MS法測定30 份市售牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物殘留量，結果表明，2 份樣品中分別檢出含有CAP、TAP殘留，其中CAP殘留量高達187.3 μg/kg，這可能是由于牛蛙飼養過程中感染病毒性、細菌性等疾病，使用酰胺醇類抗生素藥物殘留所致，市場監管部門應加強監督檢驗。

2.9 與文獻方法比較

將本研究所建QuEChERS-LC-MS/MS法與現有文獻報道[20-24]、國家標準[27-28]及行業標準[29-30]的相關檢測方法進行比較，并從儀器、檢測對象、檢出限、精密度和回收率等方面進行比較。

由表5可知，采用QuEChERS方法進行樣品前處理，經LC-MS/MS對牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物進行分析，在檢出限、精密度和回收率等方面均取得較為滿意的結果。

3 結 論

本研究采用QuEChERS技術提取凈化牛蛙肉中的CAP、TAP、FF及FF代謝物FFA，成功建立LC-MS/MS法同時測定牛蛙肉中酰胺醇類抗生素及其代謝物的方法。該法前處理簡單、分離效果好、靈敏度高、準確度好，可為牛蛙肉中酰胺醇類抗生素殘留檢測及確證提供方法。

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