SPE-HPLC測定輔酶Q10氯化鈉注射液中異構體的含量

肖中元，彭 力，李玉林，程永剛

(太極集團西南藥業股份有限公司，重慶 400038)

輔酶Q10(Coenzyme Q10、Ubidecarenone)具有調節免疫、抗氧化、延緩衰老等功能[1]。輔酶Q10劑型開發比較全面，包括片、膠囊、注射液、軟膠囊。輔酶Q10已在全球主要國家上市，包括美國、歐洲、日本等。輔酶Q10標準已列入《中國藥典》、《美國藥典》和《歐洲藥典》，并且都收載了異構體檢測項目對異構體含量進行控制，對比三種異構體檢測方法，發現色譜條件及樣品處理方法各藥典要求基本一致[2]。現國內、國外主流藥典標準中都沒有對輔酶Q10氯化鈉注射液的異構體進行檢測與控制。固相萃取(SPE)是利用固定相吸附樣品中的目標化合物，分離樣品的基體和干擾化合物，達到分離和富集目標化合物的目的。固相萃取作為樣品前處理技術[3]，在實驗室中得到了越來越廣泛的應用[4-6]。本文通過使用固相萃取進行樣品的前處理，除去輔酶Q10氯化鈉注射液中的輔料，富集輔酶Q10及異構體成分，并使用HPLC分析方法，建立了一種輔酶Q10氯化鈉注射液異構體檢測方法。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT液相色譜數據工作站( 包括四元泵、真空在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器及LabSolutions色譜工作站) ；XS205DU電子分析天平(METTLER TOLEDO)；PL203電子天平(METTLER TOLEDO)；ARIUM 611UF超純水制備儀(Sartorius)；HP-Silica色譜柱(250×4.6mm，5μm；Sepax)；CNWBOND LC-C18 SPE TUBES(500mg，3ml；CNW Technologies)。

正己烷(色譜級，天津市福晨化學試劑廠)；異丙醇(色譜級，天津市光福精細化工研究所)；甲醇(色譜級，TEDIA)；輔酶Q10系統適應性對照品(USP REFERENCE STANDARD LOT:F0B194 USP ROCKVILLE,MD)；輔酶Q10對照品(批號140611-201204，含量99.7%，中國食品藥品檢定研究院)。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

采用HP-Silica色譜柱(250×4.6mm，5μm)；以正己烷-乙酸乙酯(97∶3)為流動相；流速為每分鐘1.0mL；柱溫35℃；檢測波長為275nm；進樣體積100μL。

2.2 溶劑

以異丙醇-正己烷(1∶9)為溶劑。

2.3 溶液制備

2.3.1 供試品溶液的制備

避光操作。取預處理柱(LC-C18)一支，先用3mL甲醇活化預柱，再用3mL純水清洗預柱。取本品25mL，以約2mL/min速度，通過預柱。先用3mL純水清洗預柱，再用1mL甲醇沖洗并快速通過預柱，抽干。再用0.5mL異丙醇沖洗，最后用4.0mL正己烷沖洗，將異丙醇和正己烷清洗液收集于同一5mL量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 對照溶液的制備

精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得(臨用新制)。

2.3.3 對照品儲備液

精密稱取輔酶Q10對照品(99.7%)10.30mg，至10mL量瓶中，用溶劑溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 對照品溶液

精密吸取對照品儲備液適量，用溶劑稀釋制成2.054μg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.3.5 系統適應性溶液

精密稱取輔酶Q10系統適應性對照品 10mg，用溶劑溶解稀釋至10mL，搖勻，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 方法專屬性

取系統適應性溶液、供試品溶液、溶劑與陰性對照溶液測定(圖1)。結果表明，供試品與系統適應性溶液色譜中輔酶Q10異構體峰保留時間一致，而在相應位置陰性對照及溶劑無干擾；以輔酶Q10異構體峰計算，理論塔板數均大于18000，分離度不小于2.5，峰純度符合要求，該方法專屬性和系統適用性滿足異構體含量測定要求。

1.異構體；2.輔酶Q10

圖1 專屬性HPLC色譜圖

2.4.2 線性關系考察

精密量取對照品溶液5、10、15、20、40、50、60、75、100μL，注入高效液相色譜儀，依法測定。以對照品進樣量( ng) 為橫坐標，以輔酶Q10峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=911.019X-762.510，相關系數 r 為0．99997，表明進樣量在10.3～205.4 ng范圍內線性關系良好。

2.4.3 檢測限與定量限

精密量取對照品溶液1μL、3μL，注入高效液相色譜儀，依法測定。檢測限為2.054ng( S/N=3∶1)，為主成分進樣量的0.02%；定量限為6.161ng(S/N=10∶1)，為主成分進樣量的0.06%。

2.4.4 準確度

2.4.4.1 測定方法回收率

分別精密吸取對照品儲備液0.85mL、1.0mL、1.2mL至不同的10mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，制成低、中、高濃度供試品溶液，各3份，分別進樣100μL。計算輔酶Q10回收率(見表1)。回收率均在98.4%～100.3%之間，平均回收率為99.5%，回收率RSD為0.8%(n=9)，小于2.0%。結果表明該方法準確度良好，能夠用于樣品異構體含量測定。

表1 測定方法的回收率結果

2.4.4.2 固相萃取回收率

精密稱取輔酶Q10原料6.6mg至50mL量瓶中，用正己烷溶解稀釋至刻度，進樣100μL，計算輔酶Q10原料中異構體含量；精密稱取輔酶Q10原料22.5mg，按照樣品生產工藝處方配置成1000mL樣品，分別各取20mL、25mL、30mL通過固相萃取，制成低、中、高不同異構體和輔酶Q10量的供試品溶液，各3份，分別進樣100μL。采用外標法測定輔酶Q10含量，計算回收率。假定異構體無損失，則異構體理論量=原料異構體含量/對應輔酶Q10回收率。輔酶Q10萃取回收率(見表2)均在86.0%～89.6%之間，平均回收率為87.3%，RSD為1.37%(n=9)，小于2.0%；異構體萃取回收率(見表3)均在101.9%～107.9%之間，平均回收率為105.7%，RSD為1.8%(n=9)，小于5.0%。

表2 固相萃取后樣品輔酶Q10回收率

表3 固相萃取后樣品輔酶Q10異構體回收率結果

2.4.5 精密度試驗

2.4.5.1 重復性試驗

取同一批輔酶Q10氯化鈉注射液供試品，按供試品溶液和對照溶液的制備方法平行制備6 份供試品溶液和對照溶液，精密量取100μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，以測得的供試品中異構體含量計，RSD 為0. 9%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.4.5.2 中間精密度試驗

取同一批輔酶Q10氯化鈉注射液供試品，在不同時間及不同人員變動因素下實驗，按供試品溶液和對照溶液的制備方法制備供試品溶液和對照溶液，考察中間精密度。以測得的供試品中異構體含量計，中間精密度RSD 值為1.8%(n=12)，表明該方法中間精密度良好。

2.4.6 溶液穩定性試驗

按照供試品溶液和對照溶液的制備方法制備供試品溶液和對照溶液，置于避光25℃環境下保存，分別于制備后0、1、3、5和7 h依法進樣檢測，以測得的輔酶Q10異構體含量計，RSD 為1.3%(n=5)，表明供試品溶液在7 h 內穩定。

2.4.7 色譜條件耐用性考察

按照供試品溶液和對照溶液的制備方法制備供試品溶液和對照溶液，在流動相比例(±1%)、流速(±0.1mL/min)、波長(±2nm)、柱溫(±5℃)等色譜條件微小變化下，系統適應性試驗輔酶Q10與異構體的分離度均大于2.9，異構體含量測定結果無顯著差異，RSD均小于2.0%(n=6)。因此，該方法耐用性良好，色譜條件微小變化對異構體含量測定結果無影響。

3 小結

綜上所述，本文采用 SPE-HPLC 聯用技術，以SPE 技術除去輔料并富集樣品中輔酶Q10及異構體，為輔酶Q10氯化鈉注射液中異構體的質量控制提供了可靠的技術手段。