乙烯利對蘋果矮化砧T337幼苗硝態氮吸收、分配和利用的影響

李秀麗，鄭緒峰，姜遠茂，魏紹沖

（山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室/山東果蔬優質高效生產協同創新中心，山東泰安 271018）

氮是果樹正常生長發育所必需的大量營養元素之一，在保證植物正常代謝和生物量增加方面具有重要的作用。適量的氮肥供應可以促進果樹的營養生長、花芽分化，增強葉片的光合作用，進而提高果實的產量與品質[1]。但目前我國果園氮肥施用量遠超出果品最佳產量的需要量，高產果園每年氮肥施用量高達400～600 kg/hm2，約為國外施氮量的4～5倍[2]。過多的氮肥用量不僅導致生產成本增加，而且易引起環境污染和果實品質下降等一系列不利于農業可持續發展的負面影響[3]。果園土壤保肥能力差，導致氮肥用量大，而氮肥過量施用則加劇了果園土壤的氮素環境負荷，降低果園土壤質量，反過來促使果園氮肥用量增加，形成惡性循環[4]。因此，從保護環境和改善果實品質等多方面考慮，減少氮肥用量并相應地提高氮肥利用效率是目前果樹生產上亟待解決的問題，是綠色果業可持續發展的有力保障。

植物激素乙烯是一種簡單的氣態植物激素，它不僅能夠調節植物生長發育和適應環境脅迫，而且還影響營養元素吸收利用過程中的信號轉換，與植株對養分的吸收利用效率密切相關[5]。但是目前有關乙烯與植物營養元素利用之間的關系報道較少，它們之間的相互作用可以被應用于調節植物響應不斷變化的環境和農業可持續發展方面[6]。許晅發現乙烯生成前體物ACC (氨基環丙烷羧酸) 處理可以誘導玉米根系產生更多根毛，增大根系吸收面積和提高根系活力，從而增強植株對養分的吸收和利用能力[7]。在0～120 mg/kg等間隔的4種土壤氮水平下，200 μL/L乙烯利處理均可以改變芥菜葉片氣孔導度、葉片光合速率、植株生物量以及氮素的利用效率[8]。在氮素供應充足的條件下，乙烯利處理對氮肥利用率的影響效果尤為顯著[9]。

本試驗以現代蘋果生產中常用矮化砧木T337幼苗為試驗材料，分析比較葉面噴施乙烯利對硝酸還原酶 (nitrate reductase，NR) 和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS) 活性，以及氮素吸收、分配和利用的影響，以期為果樹生產管理中氮肥高效利用提供合理的科學依據及新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2017年3—9月在山東農業大學園藝試驗站進行，以蘋果矮化自根砧T337幼苗為試驗材料。待幼苗在育苗基質中長至9片葉左右時，選取生長勢和大小基本一致的幼苗定植于塑料盆中，每板15孔，每孔定植3株，每盆45株。每盆加入營養液3 L。先用1/2濃度Hoagland營養液預培養7天后，再換為完全營養液培養25 天，隨后饑餓處理7天，以消耗幼苗中貯存氮，預處理結束后轉入改良Hoagland營養液中進行培養。以Ca(15NO3)2(上海化工研究院生產，豐度為10.16%) 為營養液唯一氮源，氮濃度為10 mmol/L。分別對幼苗葉片噴施清水或乙烯利。試驗中所有溶液均用蒸餾水配制，各營養元素所用試劑純度為分析純，每日定時通氣。

乙烯利處理濃度為：E1，200 μL/L；E2，400 μL/L；對照為噴清水 (CK)。每個處理重復4次，每盆為1個重復。處理后每隔4天取樣，分別測定不同處理幼苗根系活力及根系和葉片的硝酸還原酶 (NR)和谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性，并于處理后第20天取樣分析幼苗15N的吸收、分配和利用。

1.2 樣品采集與測定

1.2.1 根系活力 每個處理選取9株幼苗，采用氯化三苯基四氮唑 (TTC) 法測定，用四氮唑的還原強度[μg/(g·h)]表示根系活力。

1.2.2 硝酸還原酶活性 根系和葉片中的硝酸還原酶活性參照李合生的活體法測定[10]。測定各處理生成的紅色偶氮化合物在540 nm波長下的最大吸收峰，與標準曲線對照，計算樣品中NR活性[μg/(g·h)]。

1.2.3 谷氨酰胺合成酶活性 根系和葉片中谷氨酰胺合成酶活性的測定參照趙世杰等的方法[11]。分別提取根系和葉片粗酶液，與反應液和ATP混勻后，加入顯色劑，離心，取上清液測定540 nm處的吸光值來表示 GS 活性[A/(mg·h)]。

1.2.4 幼苗15N吸收、分配和利用 處理20 d后將15N標記幼苗清洗干凈，解析為根、莖、葉三部分，在105℃下殺青30 min，隨后在80℃下烘干至恒重。樣品用不銹鋼電磨粉碎后過60目篩，混勻后裝袋備用，測定各器官15N豐度和器官全氮量。樣品全氮用凱氏定氮法測定，15N豐度在中國農業科學院農產品加工研究所用MAT-251氣體同位素質譜儀 (美國菲尼公司) 測定。

1.3 數據處理

主要計算公式：

Ndff (%) = (植物樣品中15N豐度% -15N自然豐度%) / (肥料中15N豐度% -15N自然豐度%) × 100

器官15N吸收量 (g) = Ndff × 器官全氮量 (g)

器官全氮量 (g) = 器官生物量 (g) × 氮含量 (%)

氮肥利用率 (%) =15N吸收量 (g)/施肥量 (g) × 100

氮肥分配率 (%) = 各器官從氮肥中吸收的氮量(g) / 總吸收氮量 (g) × 100

試驗數據采用SPASS19.0進行單因素方差分析，LSD法進行差異顯著性檢驗。所有數據均采用Microsoft Excel 2003進行圖表繪制，圖表中數據為平均值 ± 標準誤。

2 結果與分析

2.1 乙烯利對幼苗根系活力的影響

乙烯利處理后幼苗的根系活力均不同程度高于同時期的對照(圖1)。各處理根系活力隨處理時間延長呈現先上升后下降的趨勢，在第8天達到最大值，且不同處理間差異顯著，E1、E2處理分別比對照高19.68%和63.40%。在處理后20天內，E2處理幼苗根系活力一直明顯高于同期的對照。

圖1 噴乙烯利后T337幼苗根系活力Fig. 1 Root activities of T337 seedlings after ethephon spray

2.2 乙烯利對幼苗硝酸還原酶 (NR) 活性的影響

2.2.1 乙烯利對葉片硝酸還原酶 (NR) 活性的影響

處理后8～12天內，乙烯利處理的幼苗葉片中NR活性明顯高于對照，在第8 天不同處理的葉片NR活性均達到最大值，兩個不同濃度乙烯利處理的NR活性分別比對照高17.30%和39.38%；而16～20天的兩個處理葉片中NR活性則顯著低于對照，而且E2處理葉片NR活性低于E1(圖2A)。

2.2.2 乙烯利對根系硝酸還原酶 (NR) 活性的影響

比較幼苗葉片和根系部位處理后同一時期的NR活性，可發現對照和E1處理幼苗葉片中的NR活性在20天內一直高于同期的根系的，而E2處理12天內葉片的NR活性高于根系的，但16天后根系中的NR活性反而高于葉片的。由此推測，葉片可能在幼苗硝態氮的同化利用中更關鍵 (圖2)。

圖2 噴乙烯利后幼苗葉片和根系硝酸還原酶活性Fig. 2 Nitrate reductase activity in T337 seedling leaves and roots after ethephon spray

與處理后葉片NR活性變化相似，第8天時各個處理根系NR活性也均達到最高，其中E1和E2處理的根系NR活性分別比對照提高21.54%和36.01%。第12天后根系中的NR活性呈現下降趨勢，但是同期根的 NR 活性為 E2 〉 E1 〉 CK 處理 (圖 2B)。

2.3 乙烯利對幼苗谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性的影響

2.3.1 乙烯利對葉片谷氨酰胺合成酶活性的影響處理后12天內兩個處理葉片中GS活性比同一時期對照的高，在第8 d各處理之間GS活性差異顯著(圖3A)。E2處理葉片GS活性在4、8、12天時分別比對照高55.70%、81.03%和46.53%；E1處理葉片GS活性在第8天增幅最大，比對照增加36.21%。12天后葉片中GS活性下降，16天和20天時各處理之間差異不顯著。至第20天時，各種處理GS活性均降到0.80 A/(mg·h)左右。

2.3.2 乙烯利對幼苗根系谷氨酰胺合成酶活性的影響

對照幼苗僅在第4天時根系的GS活性低于葉片，8天后葉片GS活性一直高于根系，推測這可能是幼苗從饑餓狀態轉移到全硝態氮營養液后，根系吸收的氮素前期在根部被直接轉化利用有關。

根部GS活性隨處理時間呈現先升高后降低的趨勢(圖3B)。但乙烯利處理的幼苗根系中GS活性比對照高，其中E2處理根中GS活性在8天和12天期間分別比對照顯著提高了90.18%和85.90%。12～20天期間各處理根中GS活性出現下降趨勢，但同一時期不同處理間GS活性差異不顯著。

圖3 噴乙烯利后葉片和根系谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性Fig. 3 Glutamine synthetase activity in T337 seedling leaves and roots after ethephon spray

2.4 乙烯利對幼苗生物量的影響

表1表明，乙烯利處理的幼苗總干重比對照顯著增加，E1和E2處理分別比對照增加20.88%和39.07%。E1處理葉片干重比對照顯著增加，但根和莖干重與對照差異不顯著。E2處理根系和葉片干重顯著高于對照，分別比對照增加86.96%和28.83%。與對照相比，乙烯利處理的幼苗根冠比增加，其中E2處理差異顯著，比對照增加42.86%。

表1 噴乙烯利后幼苗各器官的生物量 (g)Table 1 Biomass of seedling organs after ethephon spray

2.5 乙烯利對幼苗各器官15N吸收利用和分配的影響

2.5.1 乙烯利對幼苗各器官Ndff值的影響

Ndff是指植株器官從肥料15N中吸收分配到的15N量對該器官全氮量的貢獻率，它反映了器官對肥料15N的吸收征調能力[12]。

與對照相比，E1處理幼苗各部位的Ndff值差異不顯著；E2處理根的Ndff值比對照顯著增加了63.14%，而莖和葉片的Ndff值差異不顯著。說明E2處理可以顯著提高幼苗根系對15N的吸收征調能力 (表2)。

表2 噴乙烯利后幼苗各器官的Ndff值 (%)Table 2 Ndff (%) in various organs of seedlings after ethephon spray

2.5.2 乙烯利對幼苗15N利用率和15N分配率的影響

器官中15N占全株15N總量的百分率反映了氮在植株中的分布及在各器官遷移的規律[13]。表3中，不同處理幼苗器官中15N的分配率均為葉 〉 根 〉 莖。E1和E2處理葉片中15N的分配率分別比對照降低了20.4%和30.6%，相應地，乙烯利處理顯著提高了幼苗根和莖15N的分配率，E1、E2兩個處理根系15N的分配率分別比對照提高33.3%、67.4%，可見E2處理對根系15N分配率提高幅度尤為明顯。

表3 噴乙烯利后T337幼苗15N的分配率 (%)Table 3 15N distribution rate of T337 seedlings after ethephon spray

從圖4可以看出，不同處理的幼苗15N利用率差異顯著，由高至低依次為E2 〉 E1 〉 CK。E1和E2處理的幼苗15N利用率分別達到12.91%和24.79%，而對照僅為9.47%，可見乙烯利處理顯著提高T337幼苗15N的利用率，E1和E2處理15N的利用率分別比對照高3.44和15.32個百分點。

圖4 噴乙烯利后T337幼苗的15N利用率Fig. 4 15N use efficiency of T337 seedlings after ethephon spray

3 討論

3.1 乙烯利對T337幼苗氮代謝相關酶活性的影響

果樹從土壤中吸收的無機態氮主要為硝態氮和銨態氮，其中根系吸收的硝酸鹽在植物體內需進一步轉化為谷氨酸和谷氨酰胺等有機氮才能被植物同化利用，而NR和GS是其轉化過程中兩個關鍵酶[14]。氮素充足條件下乙烯利處理芥菜10天后，光合速率可比對照高40.3%，葉片中NR活性和氮含量分別比對照高35.9%和26.8%，最終引起植株生物量表現出明顯差異[15]。研究表明，外源乙烯能促進側根的生長和伸長，增大根系吸收面積，顯著提高根系活力[16-17]。劉劍鋒等發現，玉米無論在干旱或復水條件下，乙烯利處理均能促進其根系生長，并提高葉片中NR活性和GS活性[18]。本試驗結果表明，不同處理T337幼苗根系及葉片中NR活性和GS活性呈現先升高后降低的趨勢，并在第8天達到最大值。推測這可能與硝酸還原酶活性誘導有關，當幼苗從饑餓狀態轉移到全硝態氮營養液后，根系會從營養液中大量吸收硝態氮，從而誘導葉片和根系部位NR及GS活性上升，而隨著營養液硝態氮不斷被幼苗轉化利用，兩種酶的活性隨后開始下降，這種變化與根系活力表現為先升高后降低的趨勢是一致的。乙烯利處理提高根系活力，增強根系對硝態氮的吸收能力，另一方面也提高了葉片和根系的NR及GS活性，因此會影響幼苗中硝態氮的轉化利用，最終導致乙烯利處理的幼苗生物量高于對照。

3.2 乙烯利對T337幼苗氮素吸收、利用和分配的影響

硝態氮是果樹重要的無機氮營養形態，多數試驗證明果樹是喜硝作物[19]。進入植物體內的硝態氮，如果不能被及時同化和利用，將會明顯影響植株的氮素同化效率和生物量的形成，進而顯著影響植物的氮利用效率[20-21]。

當土壤環境中養分供應發生變化時，植物根系也會發生一些適應性改變[22]。研究表明，乙烯利對植物營養元素的吸收利用具有重要影響。例如，營養元素缺乏條件下植物產生的乙烯可以增大根系的總吸收表面，提高轉運蛋白數量等以更好地滿足植物的正常生長和養分需求[6]。

不同供氮水平下，芥菜噴施乙烯利后，葉片的光合速率及植株生物量均顯著高于對照，并且在氮供應充足水平下尤為明顯，原因主要與處理后葉片氣孔導度增大和胞間CO2濃度升高有關[9]。不同品種對乙烯處理的響應有較大差異，4個不同品種芥菜噴施乙烯利后，對乙烯反應最敏感型品種‘Pusa Jai Kisan’葉片中Rubisco酶的活性及光合速率增加顯著高于其它品種[23]。

本試驗中乙烯利處理的幼苗總生物量，尤其是400 μL/L處理，根系部位的生物量顯著高于對照，推測這可能與T337幼苗對乙烯反應的敏感性較高有關。乙烯利處理后的幼苗光合產物向地下部供應增加，促進幼苗根系生長并增強根系對硝態氮的吸收能力；而地上部分葉片由于受氮素供應限制，生長會受到一定程度的影響，因此幼苗根冠比增大，最終導致不同處理的根系氮素分配率存在明顯差異，至試驗結束時，200 μL/L和400 μL/L乙烯利處理的幼苗根系15N分配率分別比對照增加33.32%和67.40%。

高氮供應條件下T337幼苗氮素同化和根系生長會受到抑制[24]。本試驗結果表明乙烯利能夠提高根系的氮素分配率，促進T337幼苗地下部的生長，提高根冠比。乙烯利處理的幼苗根系和葉片對硝態氮的同化能力明顯加強，最終顯著提高幼苗硝態氮利用率。200 μL/L和400 μL/L乙烯利處理的幼苗15N利用率比對照分別高3.44和15.32個百分點。本試驗結果為生產中提高果樹氮肥利用率及改善氮素分配提供了新思路，但相關研究還有待在田間試驗條件下進一步驗證。

4 結論

葉片噴施適量的乙烯利能夠提高T337幼苗的根系活力，增強根系及葉片中GS和NR的活性，促進體內硝態氮的轉化及利用，從而提高幼苗氮肥利用率及根系部位氮素的分配率，增大根冠比。