不同生態型擬南芥耐銨毒害差異的生理機制

韓慶芬，陳海飛，張振華

（湖南農業大學資源環境學院/南方糧油作物協同創新中心，湖南長沙 410128）

氮是植物體內重要化合物氨基酸、蛋白質、核酸等的重要組成元素。隨著人類對糧食需求的劇增，農民普遍大量使用氮肥[1]。另外，銨態氮的大量施用導致水體以及大氣銨濃度不斷增加，通過灌溉進入土壤，大氣中的銨沉降再進入水體和土壤，造成植物銨毒害以及環境污染。研究指出全世界土壤中的銨態氮濃度在2～10 mmol/L范圍內變化[2]，引發了生態環境危機，如森林退化、藻類滅絕、生物多樣性降低，甚至更為嚴重的生態危機。有報道認為自然界中植物生物多樣性的銳減甚至部分物種的滅絕與大氣銨沉降有關[3-7]。另外在南方長期的稻油輪作體系下由于低pH以及土壤漬水造成油菜銨毒害，氮素利用效率下降等農業生產問題[8]。植物對氮的響應取決于其基因型和外界環境條件，外界環境包括氮的形態、氮的濃度等[9-10]，研究表明高氮反而降低作物的氮素利用效率，低氮提高作物的氮素利用效率，另外擬南芥等十字花科作物對銨較敏感，因此本文采用1 mmol/L硫酸銨處理95份擬南芥生態型群體，依據其對環境的適應性差異以及氮素利用效率的不同，來研究其在耐銨毒害機制方面的差異。

銨毒害主要癥狀是抑制地上部生長、胞質pH紊亂、光合作用下降、碳水化合物缺乏、碳氮代謝失衡、氮代謝缺少碳骨架，從而造成銨毒害。水培試驗研究發現番茄銨毒害與光合能力下降有關，但是也有不同觀點[11-12]。銨離子導致介質或者體內pH平衡被破壞[13-15]，但是很多情況下毒害也會在pH緩沖體系中產生[16]。碳水化合物的缺乏可能是氨毒害產生的原因，因為銨離子的同化必須在根部進行，造成了局部碳缺乏，但是外源添加碳源僅僅能夠減輕部分植物的毒害癥狀[17]。陽離子不平衡也被認為是氨毒害產生的原因之一，長期處于銨離子條件下，植物組織中的一些重要離子，如K+、Ca2+和Mg2+等會減少[18-20]，但是這可能是一種長期的營養不平衡導致的。還有研究表明銨毒害是由于無效的NH4+/NH3跨膜導致的能量損耗，銨在進入根系過程中會有很大一部分又跨膜排出，這種無效的銨轉運造成了能量消耗[20-21]。Li等研究發現銨毒害使擬南芥地上部產生大量乙烯，導致衰老[23]，但是這些都是銨毒害發生后的一些表型。除此之外，研究人員通過篩選銨敏感相關突變體，利用遺傳突變體來剖析植物銨耐性機制，并發現了一些與植物銨敏感相關的基因[22-25]，但是這些基因都位于氨毒害下游，不能從根本上解釋植物銨累積的發生機制。油菜和擬南芥同屬十字花科植物，在長期銨毒下其地上部銨大量累積，并且擬南芥與油菜GS1同源基因較多，各有5個基因亞族[26-27]。因此本文通過研究擬南芥生理指標以及各指標間相關性分析，篩選極端材料解析氨毒害的發生機制，為后續挖掘耐性基因提供生理基礎，并為稻田油菜耐銨毒害的遺傳改良提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用植物材料為95份不同生態型擬南芥[28]。

1.2 植物培養條件

試驗所用擬南芥種子經75%乙醇滅菌15 min，無菌水清洗三次，放置4℃冰箱浸種四天，播于蛭石、珍珠巖 (3∶1) 混合而成的土中。移苗前，80℃的烘箱中烘人工土兩小時，用正常水培營養液浸濕，保鮮膜密封，于溫室培養三天后揭掉保鮮膜，7天后移苗至水培，挑選長勢一致的壯苗，用海綿包裹植株根部，移栽至55 cm × 37 cm × 8 cm的水培盒中，每盆104株，盆外圍用黑色膠帶包裹以避光，約4天換一次植物培養液。正常水培培養液成分為：1 mmol/L KNO3、0.625 mmol/L KH2PO4、0.5 mmol/L MgSO4、0.5 mmol/L Ca(NO3)2、0.025 mmol/L Fe-Na2-EDTA、70 mmol/L H3BO3、14 mmol/L MnCl2、1 mmol/L ZnSO4；0.2 mmol/L NaMoO4、10 mmol/L NaCl、0.01 mmol/L CoCl2、0.5 mmol/L CuSO4以及2.5 mmol/L MES (用來緩沖營養液pH)，pH用KOH調至5.8左右。正常水培營養液中含2 mmol/L硝態氮。

溫室培養條件：相對濕度保持在70%左右，溫度控制 22～24℃，光強 80～200 μmol/(m2·s)，光照周期為16 h/8 h (長日照)。

1.3 試驗處理

移苗后培養8天后，一半的擬南芥幼苗繼續在原營養液中 (硝態氮處理) 培養，一半進行銨態氮處理。采用含1 mmol/L硫酸銨處理的營養液進行培養，其成分為：1 mmol/L (NH4)2SO4、0.625 mmol/L KH2PO4、0.5 mmol/L CaCl2、1 mmol/L KCl、0.5 mmol/L MgSO4、0.025 mmol/L Fe-Na2-EDTA、70 mmol/L H3BO3、14 mmol/L MnCl2、1 mmol/L ZnSO4、0.2 mmol/L NaMoO4、10 mmol/L NaCl、0.01 mmol/L CoCl2、0.5 mmol/L CuSO4。此液中含2 mmol/L 銨態氮。培養3天時，取樣分析植株根部銨態氮轉運蛋白基因表達量；處理8天后取樣分析植株全氮量，地上部游離銨含量，以及谷氨酰胺合成酶活性；各試驗處理設置4次生物學重復。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 游離銨含量的測定采用靛酚藍比色法測定[29]

取銨處理8天的擬南芥幼苗地上部，用蒸餾水沖洗3～4次，用濾紙擦干表面水分，稱重后裝入5 mL離心管，放入液氮冷凍一小會兒于組織研磨儀上打碎，用5 mL 0.1%稀鹽酸提取半小時，過濾后吸取上清液200 μL用0.1%稀鹽酸稀釋至4 mL，依次加入0.5 mL苯酚溶液 (苯酚5 g、亞硝基鐵氰化鈉50 mg定容至500 mL) 和次氯酸鈉堿性溶液 (氫氧化鈉5 g，磷酸氫二鈉3.53 g，磷酸鈉15.9 g，量取次氯酸鈉[ω(NaClO)=5.25%，即含有效氯5%的漂白劑溶液]溶液5 mL，溶解后轉移至500 mL容量瓶后定容)，搖勻后37℃水浴30分鐘，在625 nm波長處進行比色。

1.4.2 谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性的測定 銨處理8天后，植株地上地下部分開取樣，剪碎入提前置于低溫冰箱冰凍30 min的研缽中，置于冰浴中加少量石英砂及Tris-HCl緩沖液3 mL，研磨勻漿，置于4℃、10000 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶提取液。反應液的組成如下：0.6 mL咪唑-鹽酸緩沖液(0.25 mol/L，pH 7.0)，0.4 mL 0.3 mol/L谷氨酸鈉，0.4 mL 0.3 mmol/L ATP二鈉鹽溶液，0.2 mL 0.5 mol/L MgSO4，1.2 mL酶液。反應液在25℃水溶液中保溫5分鐘，加入0.2 mL羥胺試劑，以開始反應，在25℃水浴中再保溫15 min，加入1 mL FeCl3試劑終止反應。混合液在10000 r/min下離心10 min，上清液在540 nm處測定吸光度，空白加酶液前加入FeCl3試劑[30]。

1.4.3 植株全氮 采用H2SO4-H2O2消煮法及連續流動分析儀AA3測定[31]。銨處理8天后整株取樣裝在小信封袋內于105℃殺青半小時后65℃烘干至恒重，采用千分之一天平稱重后裝于150 mL細口三角瓶，用H2SO4-H2O2消煮至透明清亮，轉移至50 mL容量瓶中，定容、過濾后用連續流動分析儀AA3進行分析 (Autoanalyzer 3，SEAL，Germany)。

1.4.4 RT-PCR 銨處理3天后取根部于液氮中，總RNA提取用TRIzol(Invitrogen，美國)，用等體積的異丙醇沉淀，用75%乙醇洗滌，并溶于不含RNase的水中。cDNAs合成采用PrimeScriptTMRT Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time，TAKARA日本) 試劑盒，操作步驟依照試劑盒的操作說明進行。使用SYBR Premix Ex-Taq(TAKARA) 試劑和Applied BiosystemsStepOneTM儀器進行RT-qPCR。

采用表1的目標基因和參考基因的引物序列進行qPCR擴增，測定AtAMT1;1和AtAMT1;2的相對表達量。

1.4.515N示蹤分析 為了測定1 mmol/L硫酸銨處理下銨的吸收，擬南芥幼苗移苗后在正常培養液中培養8天，進行15N標記。將根部置于1 mmol/L CaSO4中沖洗1 min，然后轉移至1 mmol/L豐度為5%的 (15NH4)2SO4中培養，分別在處理3 h、6 h和24 h取樣，取樣前將根部置于1 mmol/L CaSO4中沖洗1 min，取地上部于80℃烘干至恒重，用組織研磨儀打碎至粉末狀，稱2 mg用于同位素分析[32]。

表1 擬南芥qRT-PCR引物序列表Table 1 Sequences of qRT-PCR primer for Arabidopsis thaliana

1.5 數據分析與處理

試驗所得數據用Microsoft Excel 2010軟件計算并作圖，用DPS 7.05和IBM SPSS_Statistics軟件統計分析。

2 結果與分析

2.1 硝態氮和銨態氮條件下不同生態型擬南芥中游離銨含量差異分析

經過2 mmol/L銨態氮處理8天后，除了Tscha-1低于對照，ukID48與對照相比無差異，各生態型擬南芥銨含量顯著高于對照2 mmol/L硝態氮處理 (圖1)。其中，uk-2硝態氮處理下銨含量為2.17 μmol/g，銨態氮處理下銨含量為3.21 μmol/g，是對照的1.5倍；1187-G7硝態氮處理下銨含量為1.8 μmol/g，銨態氮處理下銨含量為 18.18 μmol/g；Si-0、fab-4、Ba-0、Dralv1-f銨態氮下銨含量是硝態氮下的10倍以上，這表明銨態氮條件下不同生態型擬南芥體內銨大量累積。

2.2 擬南芥群體游離銨含量與銨耐受性間的相關性

為了研究95種不同生態型擬南芥群體在長期低銨環境下的耐受性差異，分別測定了其在兩種不同氮形態下地上部游離銨的含量，分析了其生長狀況與游離銨含量的關系。在硝態氮和銨態氮條件下，地上部銨含量與其生物量呈對數函數關系，隨著銨含量的增加其生物量遞減（圖2-a、b），說明地上部銨含量越高的生態型其氮素利用效率越低。由圖2-b可見，大多數生態型都是銨依賴型的，說明銨含量越高，其耐銨性越差，部分是非銨依賴型的，其地上部銨含量都比較高，但有耐銨和不耐銨的生態型。因此，本文以擬南芥群體組織內游離銨的濃度為主因子，篩選出銨依賴生態型中的耐銨和銨敏感兩組擬南芥生態型各三個，其中Or-1、Ta-0、HSM為耐銨型；Rak-2、Lpv-18、Hi-0為銨敏感型。

圖1 2 mmol/L硝態氮和銨態氮條件下不同生態型擬南芥游離銨含量差異Fig. 1 Differences of ammonium contents in different ecotypes of Arabidopsis under 2 mmol/L NHN and NON conditions

2.3 不同生態型擬南芥對銨毒害的響應

已篩選擬南芥銨處理8天后，整株取樣，如圖3所示，耐銨擬南芥的單株生物量下降的比例顯著低于銨敏感生態型。由于擬南芥根部生物量較小，因此只測定了地上部銨含量。圖4表明在硝態氮下，耐銨生態型Or-1、Ta-0、HSM的銨含量分別為0.74、0.39、1.06 μmol/g，銨敏感生態型 Rak-2、Lpv-18、Hi-0的銨含量分別為1.76、2.59、3.98 μmol/g；在銨態氮下，耐銨生態型Or-1、Ta-0、HSM的銨含量分別為6.44、2.63、8.83 μmol/g，銨敏感生態型Rak-2、Lpv-18、Hi-0的銨含量分別為13.08、20.83、15.55 μmol/g。兩種氮形態下耐銨型擬南芥地上部銨含量均顯著低于銨敏感生態型，表明2 mmol/L銨態氮脅迫下，耐銨型生態型擬南芥長勢更好，具有更高的氮素利用效率，銨毒害較輕。

圖2 銨態氮和硝態氮處理下擬南芥群體體內游離銨濃度與地上部生物量的關系Fig. 2 Correlation between shoot weight and free ammonium concentration in Arabidopsis population

圖3 兩組生態型擬南芥在硝態氮與銨態氮下總生物量下降的百分比Fig. 3 Percentage of reduction in total biomass of the tolerant and sensitive ecotypes of Arabidopsis under NOand NH treatments

圖4 硝態氮和銨態氮處理擬南芥地上部銨含量Fig. 4 Ammonium contents in the shoot of Arabidopsis under NOand NH treatments

2.4 不同生態型擬南芥銨吸收差異分析

銨脅迫主要使擬南芥地上部發生毒害。由圖5-a可知，耐銨生態型氮吸收總量顯著高于銨敏感生態型。圖5-b同位素示蹤結果表明，處理3 h、6 h和24 h下耐銨生態型15N累積量均顯著高于銨敏感生態型，結合圖4地上部銨含量結果，說明耐銨能力強的品種，銨的同化能力較強，所以植株體內銨離子濃度較低。

圖5 擬南芥植株總氮吸收量及15NH4+-N不同處理時間下地上部15N累積量Fig. 5 Plant total N and 15N accumulation in shoots of Arabidopsis after different treating hours with 15NHN

圖6結果表明，2 mmol/L銨態氮處理72 h后，耐銨型擬南芥根系銨轉運蛋白基因AMT1;1和AMT1;2的表達水平顯著高于銨敏感型，說明在低濃度銨脅迫下耐銨生態型擬南芥對銨的吸收能力更強，并且地上部的銨含量顯著低于銨敏感型，所以才具有更高的氮素利用效率且受銨毒害較輕。

2.5 不同生態型擬南芥銨同化能力差異分析

谷氨酰胺合成酶 (GS) 的高低代表著銨態氮的同化能力。耐銨生態型Or-1、Ta-0、HSM在硝態氮下其地上部 GS 活性分別為 3.91、4.01 和 4.74 μg/(g?h)，銨敏感生態型Rak-2、Lpv-18、Hi-0 GS活性分別為3.41、2.65、3.03 μg/(g·h)，硝態氮條件下耐銨生態型地上部GS活性顯著高于銨敏感生態型 (圖7-a)。耐銨生態型Or-1、Ta-0、HSM在銨態氮條件下其地上部 GS 活性分別為 6.45、6.18、5.97 μg/(g?h)，銨敏感生態型Rak-2、Lpv-18、Hi-0 GS活性分別為4.99、4.68、4.18 μg/(g?h)，耐銨生態型地上部 GS 活性同樣顯著高于銨敏感生態型 (圖7-b)。在硝態氮下，耐銨生態型Or-1、Ta-0、HSM的根系GS活性依次為22.83、30.93、25.04 μg/(g?h)，銨敏感生態型 Rak-2、Lpv-18、Hi-0 GS活性分別為18.89、21.89、20.38 μg/(g?h) (圖7-c)，在銨態氮下，耐銨生態型Or-1、Ta-0、HSM根系的GS活性分別為29.99、33.19、28.46 μg/(g?h)，銨敏感生態型 Rak-2、Lpv-18、Hi-0根系 GS 活性分別為 20.60、23.46、25.43 μg/(g?h)，(圖7-d)，耐銨型生態型根系GS活性在硝態氮和銨態氮條件下均顯著高于銨敏感生態型。結合圖4結果，耐銨生態型的銨含量顯著低于敏感生態型，表明耐銨型生態型高效的同化速率降低了擬南芥體內的游離銨含量，從而緩解了銨毒害。

圖6 不同生態型擬南芥銨轉運基因的表達水平Fig. 6 Expression levels of ammonium transport genes in different ecotypes of Arabidopsis thaliana

圖7 銨態氮和硝態氮處理下銨耐受型和敏感型擬南芥谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性Fig. 7 Glutamine synthetase activity in shoot and root of ammonium tolerant and sensitive ecotypes of Arabidopsis thaliana

3 討論

植物對氮的響應由其基因型和外界環境因子決定，外界環境因子有氮的形態、氮的濃度等。研究表明高濃度氮反而降低氮素利用效率，因此培育一些低氮適應性且高效品種是非常重要的。目前對植物利用硝態氮的生理分子機制研究得較多，但是植物對銨態氮響應上游的機制并不太清楚，另外，植物體內氮的同化主要分為硝態氮和銨態氮同化，其中首先需要依次在細胞質和葉綠體或根中經過硝酸還原酶 (NR) 和亞硝酸還原酶(NiR) 還原為后，才能進一步經過的同化途徑谷氨酰胺合成酶 (GS) 和谷氨酸合成酶 (GOGAT)途徑同化[33-34]為植物體可利用的有機態氮，因此植物體內銨態氮的同化是植物氮同化中最為重要的。因此本文通過研究95份不同生態型擬南芥對2 mmol/L銨耐性差異的機制，從吸收代謝揭示耐銨生態型擬南芥主要是具有較強的銨吸收能力及同化能力，從而降低了擬南芥體內游離銨的含量，緩解了銨毒害。

3.1 銨的累積對不同生態型擬南芥生長的影響

大量銨累積會使植物發生毒害，導致葉片黃化，生物量和凈光合速率顯著下降[35]。而不同遺傳背景的生態型擬南芥對銨的響應各有不同，如圖1所示，不同生態型在硝態氮和銨態氮培養下其體內游離銨的含量各不相同，Tscha-1和ukID48對銨不敏感，而大多數生態型對銨較敏感，尤其是1187-G7、Si-0、fab-4、Ba-0、Dralv1-f對2 mmol/L銨很敏感，因此本研究結果表明不同基因型對銨的適應性各不同。Sarasketa等研究了47份不同生態型擬南芥，結果表明在硝態氮培養下其體內游離氨含量與生物量呈顯著負相關[36]，本研究圖2-a結果同樣表明兩者呈顯著負相關性，圖2-b結果表明銨態氮培養下其體內游離氨含量與生物量呈顯著負相關，可能相比外源銨，植物對內源銨的響應更為重要，在硝態氮下耐銨的品種在銨態氮下同樣耐銨，氮素利用效率更高，并且不同的生態型對銨的吸收和同化能力可能有差異。

3.2 不同生態型擬南芥對銨吸收代謝能力差異的影響

氮素利用效率由吸收和同化兩個途徑決定，植物主要通過銨態氮轉運蛋白 (AMTs) 從外界環境中吸收進入根部[37]，進而通過谷氨酰胺合成酶 (GS) 和谷氨酸合成酶 (GOGAT) 途徑同化。前人用GS抑制劑處理水稻根部，發現木質部和地上部15NH4+顯著下降，說明銨的同化大部分在根中進行，但仍有一定數量的NH4+通過木質部向上運輸[38-39]，這部分NH4+進一步通過地上部的GS被同化或以NH3的形式損失[22]。銨同化酶GS主要有兩種同工酶，分別是GS1和GS2，擬南芥中編碼GS1的有5個同源基因，主要在氮的再利用中發揮作用，GS2主要在硝酸鹽還原為銨以及光呼吸產生銨的同化中起作用，所以具有高活性GS的植物對銨的耐受性更強[40]。15N示蹤試驗 (圖5) 結果表明，根部未被同化的NH4+進一步被轉運到地上部進而被GS同化，并且耐銨生態型通過加強地下部銨的同化，及減少往地上部的轉運從而減輕銨毒害。另外，前人研究發現AtAMT1;1轉錄水平與根部谷氨酰胺濃度成反比，因此抑制AtAMT1;1基因轉錄的關鍵因子不是而是的下游同化產物谷氨酰胺[41]。本研究發現在直接供銨的條件下耐銨生態型吸收更多的銨(圖6-a，b)，在根部被大量同化 (圖7-c，d)，15N標記試驗結果表明耐銨生態型地上部NH4+含量顯著低于銨敏感生態型，說明有更少的銨被轉移到地上部，并且進一步被同化 (圖7-a，b)，所以銨毒害較輕。因此，在2 mmol/L銨態氮條件下耐銨生態型具有較高的銨態氮同化能力，而不是抑制銨態氮的吸收。

目前關于植物銨毒害的原因有很多種，但是并沒有從基因水平真正說明其毒害原因，已發現的幾個與銨相關的基因都位于銨毒害的下游，因此本文解釋了耐銨生態型擬南芥耐銨毒害的生理機制，為后續挖掘耐銨基因提供生理基礎，以及為湖南省長期稻油輪作下油菜的遺傳改良提供理論指導。

4 結論

2 mmol/L銨顯著抑制不同生態型擬南芥地上部的生長，且銨大量累積于地上部，銨含量是硝態氮下的1.5倍以上，其中有5個生態型達到了10倍以上。耐銨型擬南芥是通過根部銨轉運蛋白從外界吸收更多的銨，同時耐銨生態型擬南芥GS活性是銨敏感擬南芥的1.2倍，在較高GS活性下被同化，從而降低了根部游離銨含量，并且耐銨生態型擬南芥全氮和地上部15N的累積較敏感型擬南芥高，地上部GS活性較敏感型顯著提高，說明耐銨能力強的品種，銨的同化能力較強，減少了植株體內的銨含量，從而減輕銨對擬南芥地上部的毒害。