低鉀脅迫下外源生長素對煙草根系生長及鉀吸收的影響

郭 澤，李子紳，代曉燕，王英鋒

（河南農業大學煙草學院/煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州 450002）

鉀是植物細胞中含量最豐富的陽離子之一[1]，約占植物干重的2%～10%[2]。鉀元素參與了植物生長發育的許多過程[3]。雖然土壤中鉀離子濃度一般在0.025～5 mmol/L范圍內[4]，但植物根際中的鉀離子濃度常低于0.3 mmol/L[5]，所以大田農作物經常處于缺鉀狀態。而植物根系是對缺鉀信號最敏感的原初器官，植物對鉀素的吸收主要取決于其根系。因此，研究低鉀脅迫下植物根系的生長發育及吸鉀狀況，對提高植物體內鉀素水平具有重要意義。對擬南芥低鉀脅迫下鉀離子信號傳導途徑研究表明：第一，低鉀脅迫可引起H+-ATPase活性的提高，導致質膜的超極化和細胞外酸化，前者可激活內流型鉀離子通道AKT1和可滲透性鈣離子通道，后者可促進HAK5類鉀離子轉運體調控的鉀吸收；第二，低鉀可誘導根細胞中活性氧的累積，最終調控HAK5類鉀離子轉運體的轉錄變化[6-7]和激活AKT1等鉀離子通道的活性，從而調控鉀離子的吸收[8]。進一步的研究表明，低鉀脅迫下，植物根系的生長會發生變化，這是由于低鉀脅迫可誘導乙烯的產生，促進中柱生長素運輸基因PIN3和PIN7的轉錄量增加，從而影響生長素在植株根系中的分布[9]。乙烯也可促進生長素從根尖到分生區的運輸量，大量積累的生長素抑制了植物主根的生長，說明低鉀脅迫可刺激植物激素生長素的合成進而影響植物根系形成，也說明生長素是低鉀脅迫信號傳導的主要因素和植物根系對鉀素吸收運輸的重要物質。對于生長素影響鉀素吸收轉運的研究集中在頂端調控的情況下，如郭麗琢等[10]研究發現，煙株打頂后用NAA處理莖斷口，煙株及煙葉內K的最終積累量增加。洪麗芳等[11]利用86Rb標記示蹤原子法研究發現，當煙草施用生長素以后，86Rb在木質部中的運輸量增強，在韌皮部中下運的量降低，因此有利于鉀素在煙葉中的積累。進一步對鉀離子通道與植物激素類物質的關系研究發現，打頂抑制了鉀離子通道基因在煙葉中的表達，誘導其在根中的表達，且打頂后在植物頂端涂抹生長素類物質，可抑制因打頂引起的鉀離子通道基因在煙葉和根系中的表達[12]。這說明打頂后涂抹生長素可能通過引起植物體內相關鉀離子轉運蛋白的轉錄表達，進而影響植物對鉀素的吸收。目前對于生長素與鉀素吸收積累與轉錄分析的調控研究都是在頂端調控下進行的，而對于植物吸收鉀離子的主要部位根系的調控研究較少，且對生長素參與調控煙株根系鉀離子的吸收和運輸機制并不清楚。本文以模式植物煙草為研究材料，采用室內水培的方法，通過對煙株根系進行不同濃度的鉀素及外源生長素處理，探索生長素參與調控煙草根系的吸鉀機理，以期為理解低鉀脅迫下植物的吸鉀機制提供理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 供試材料與材料培養

供試材料為煙草品種‘豫煙6號’，試驗在河南農業大學煙草行業煙草栽培重點實驗室進行。煙草種子完成催芽后，均勻移栽在裝有Hoagland全營養液和珍珠巖的黑色小盆容器中，然后放置在光照培養箱中生長，培養條件：晝溫 (28 ± 2)℃，夜溫(18 ± 2)℃，光周期14 h，光照強度4000 lx，相對濕度65%～70%。

1.2 試驗處理

當煙苗長至3片真葉時，挑選長勢一致的煙苗，用去離子水洗凈根系后移至水培盒子進行水培處理。首先放入無鉀的Hoagland全營養液進行鉀饑餓48 h，再分別置于不同的鉀水平營養液中進行培養。試驗共設2個鉀水平，分別為正常供鉀 (5 mmol/L)和低鉀 (0.15 mmol/L)[13]，培養期間用通氣泵間歇通氣。為保持營養液中的養分濃度相對穩定，每隔4 天換一次營養液。營養液除鉀水平不同外，其它成分含量均按照Hoagland全營養液方法進行。鉀處理8天后同時添加不同濃度的外源生長素進行處理，外源生長素為3-吲哚乙酸，共設5個濃度：0、5、10、20、40 μmol/L (前期進行大量探索試驗發現，生長素濃度過高時，根系生長會出現直接壞死，因此，本文生長素濃度的設置為前期試驗篩選所得)。生長素使用時用無水乙醇按50 mg/mL的比例進行溶解。處理4 d后取樣測定相應指標，每個處理6次重復。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 根系及地上部干重 分別取植株根系及地上部，在105℃烘箱中殺青30 min后，65℃中烘干至恒重，分別測定根系及地上部干重。

1.3.2 根系掃描特征 待處理時間結束后，迅速剪取煙草完整根系，通過數字化掃描儀 (EPSON Expreeion 1000XL) 對根系進行掃描，之后用WinRHIZO根系分析系統軟件對根系八項指標 (總根長、根體積、根總表面積、根投影面積、根平均直徑、根尖數、根分叉數和根交疊數) 進行定量分析。

1.3.3 根系生理指標 根系活力測定采用TTC (氯化三苯基四氮唑) 法[14]；根系H+-ATPase活性根據試劑盒使用步驟進行測定[15](試劑盒購自南京建成生物工程研究所)；根系可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250比色法[16]測定。

1.3.4 植株各部位生長素濃度 分別采集主根尖(0～2 cm)、側根尖 (0～2 cm) 和頂部第一片功能葉片0.5 g新鮮煙草樣品，用液氮速凍后，存放于-80℃冰箱中保存，采用間接酶聯免疫吸附法 (ELISA)[17](酶免疫試劑盒由中國農業大學化控中心提供) 進行測定。

1.3.5 植株各部位鉀素濃度 精確稱取烘干磨碎過0.2 mm篩的樣品0.1000 g左右，采用1 mmol/L鹽酸-火焰光度計法[18]，測定植株根系及地上部鉀含量。

1.3.6 根系鉀吸收動力學參數 參照Xu等[8]的溶液耗竭方法進行試驗。取供試煙苗在無鉀營養液中饑餓處理2天，期間每天換饑餓液1次。耗竭試驗開始時，將煙苗裝入含50 mL耗竭液的黑色三角瓶中(耗竭液由 0.4 mmol/L KNO3、0.2 mmol/L CaSO4組成)，每隔12 h取樣一次，直到耗竭液中鉀濃度接近零時結束取樣。每次取10 mL耗竭液，取樣后用10 mL去離子水補充。用火焰光度計測定耗竭液鉀濃度。以耗竭液的鉀濃度為縱坐標，耗竭時間為橫坐標作鉀離子耗竭曲線，得出一元二次方程模型Y=a+bX+cX2，其中X代表吸收時間，Y代表該時刻耗竭液中鉀濃度。

結合Li和Ma的方法[19]，計算根系鉀吸收動力學參數Vmax = [b× 耗竭液體積 (mL)]/[0.06 × 鮮根重(g)]，Km =a- 3b2/16c，Cmin=a-b2/4c，其中a、b、c不考慮正負號。

1.3.7 鉀離子相關通道基因表達量 鉀離子通道相關基因的相對表達量采用實時熒光定量PCR法測定：采用trizol法提取總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計 (Thermo Scientific，USA) 測定濃度及OD260/OD280，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+ gDNA wiper) (Vazyme，R223-01) 將待測RNA逆轉錄成cDNA。引物采用Roche LCPDS2軟件設計并由北京擎科新業生物技術有限公司合成，引物序列如表1。內參基因為煙草ACTIN基因。利用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit試劑盒 (Qiagen，Germany)在LightCycler?480 Ⅱ型熒光定量 PCR 儀 (Roche，Swiss)上進行反應。體系：2 × QuantiFast?SYBR?Green PCR Master Mix，5 μL；10 μmol/L Forward primer，0.2 μL；10μmol/L Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR 程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個循環。循環結束后利用熔解曲線檢測產物特異性：從60℃緩慢升溫至97℃，每℃采集5次熒光信號，引物序列見表1。

表1 煙草鉀離子通道相關基因引物序列Table 1 Tobacco potassium channel related gene primer sequence

1.4 數據處理

采用Excel 2016進行數據整理和作圖，SPSS21.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 生長素參與不同鉀水平下對植株根系生長的影響

圖1 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長素處理煙草根系及地上部干物質重Fig. 1 Root and aboveground dry matter weight of tobacco plant as affected by different exogenous auxin concentrations under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

2.1.1 植株根系及地上部干物質重 如圖1所示，正常供鉀水平下植株根系和地上部干物質累積量整體高于低鉀水平，其中在生長素濃度為0 μmol/L時，地上部干重差異顯著。添加生長素以后，無論正常供鉀或是低鉀條件下，隨著外源生長素濃度的增加，根系和地上部干重均呈現先升高后降低的趨勢，且均在生長素濃度為10 μmol/L時達到最大值，其中地上部干重在生長素濃度為10 μmol/L時與其余處理差異達到顯著水平 (P〈 0.05)。

2.1.2 植株根系掃描特征 由表2可知，正常供鉀水平下各項指標 (總根長、根總體積、根總表面積、根投影面積、根平均直徑、根尖數、根分叉數、根交疊數) 數值均明顯高于低鉀水平相應處理，且大部分差異達到顯著水平 (P〈 0.05)，其中在生長素濃度為0 μmol/L的條件下，正常供鉀植株根尖數高達低鉀植株的4.38倍；在生長素濃度為5 μmol/L的條件下，正常供鉀植株根系總長度高達低鉀植株的2.38倍，根系總體積可達低鉀植株的2.91倍，說明低鉀脅迫顯著影響植株根系的生長發育。在正常供鉀條件下，各項根系指標隨著外源生長素濃度的增加變化規律表現不一致，且趨勢不明顯。但在低鉀條件下，根系的總長度和根尖數均表現出隨著外源生長素濃度的增加先增加后降低的趨勢，且均在外源添加生長素濃度為10 μmol/L時達到最高且與其余處理相比差異達到顯著水平 (P〈 0.05)，根平均直徑的變化規律與其正好相反，其他幾項指標變化規律呈波浪線趨勢。

表2 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長素處理的煙草植株根系掃描特征Table 2 Root scanning characteristics of exogenous auxin treated tobacco plants under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

2.1.3 植株根系生理特征 如圖2-a所示，未添加生長素時，正常供鉀與低鉀植株根系活力差異不顯著。添加生長素以后，在常鉀條件下，隨著外源生長素濃度的增加，根系活力呈先減少后增加又減少再增加的波浪型趨勢。低鉀情況下，根系活力隨著所添加生長素濃度的增加呈先增加后降低的單峰變化趨勢，其中在生長素濃度為10 μmol/L時達到最大，且為不添加生長素處理的3.3倍，與低鉀其他處理差異達到顯著水平 (P〈 0.05)。

如圖2-b所示，在未添加外源生長素的情況下，常鉀植株ATPase活性顯著高于低鉀處理，說明低鉀脅迫可降低植株根系質膜ATPase的活性。添加外源生長素以后，低鉀水平植株ATPase活性整體高于正常供鉀水平，且隨著生長素濃度升高，正常供鉀條件煙株根系ATPase活性表現為先降低后增加后又降低的波浪型趨勢；低鉀條件下根系ATPase活性表現為先增加后降低的單峰型趨勢，在生長素濃度為10 μmol/L時達到峰值，為不添加生長素處理的1.89倍，且與低鉀其余處理間差異達到顯著水平 (P〈 0.05)。

由圖2-c可知，除了外源生長素濃度為40 μmol/L時，其他生長素濃度條件下，低鉀水平可溶性蛋白含量均高于常規鉀水平處理，說明低鉀脅迫仍可刺激根系的代謝活動。無論正常供鉀或是低鉀條件下，隨著外源生長素濃度的增加，植株根系中可溶性蛋白含量都呈現為先增加后降低的趨勢，其中常鉀植株在生長素濃度為10 μmol/L時可溶性蛋白含量達到最大值，低鉀植株在生長素濃度為5 μmol/L可溶性蛋白含量達到最大值，且與低鉀其他處理相比差異達到顯著水平 (P〈 0.05)。

圖2 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長素處理煙草根系生理特征Fig. 2 Physiological characteristics of roots of exogenous auxin treated tobacco plants under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

2.1.4 植株各部位內源生長素濃度分布特征 如圖3-a所示，在主根尖內源生長素中，除了外源生長素濃度為20 μmol/L外，其他4個外源生長素濃度條件下，低鉀水平根尖內源生長素濃度均高于正常供鉀水平。無論正常供鉀或是低鉀條件下，隨著外源生長素濃度的增加，主根尖內源生長素濃度整體呈現增加的趨勢，且均在外源生長素濃度為40 μmol/L時達到最大值28.39和20.57 ng/g, FW。

由圖3-b可知，在側根尖內源生長素中，添加不同濃度的外源生長素后，低鉀水平側根尖內源生長素濃度均高于正常供鉀水平。無論正常供鉀或是低鉀水平，添加生長素以后，側根尖內源生長素均表現出增加趨勢，其中在生長素濃度為0～20 μmol/L時變化不大，在生長素濃度為20～40 μmol/L時內源生長素濃度迅速增加達到最大值且與其余處理間差異達到顯著水平 (P〈 0.05)。

圖3 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長素處理植株各部位內源生長素濃度Fig. 3 Endogenous auxin concentration in various parts of exogenous auxin-treated tobacco plants under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

由圖3-c可知，在葉片內源生長素中，低鉀水平下葉片內源生長素濃度整體均高于正常供鉀水平。正常供鉀水平下，隨著外源生長素濃度的增加，葉內源生長素濃度表現為先降低后增加又降低的規律；低鉀水平下，在外源生長素濃度為0～10 μmol/L時，葉內源生長素濃度呈現降低趨勢，在生長素濃度為10 μmol/L時最低，為35.88 ng/g, FW，之后隨著外源生長素濃度的升高，葉片內源生長素濃度開始升高。

2.2 不同鉀水平下生長素對植株體內鉀素吸收的影響

2.2.1 植株各部位鉀素濃度 由表3可知，鉀水平、生長素濃度以及兩者互作3個因素均對植株各部位鉀素濃度有顯著影響，對鉀素的貢獻率分別達到了83.9%、3.50%、12.5%，說明鉀水平對植株各部位鉀素濃度起著關鍵作用，其次是兩者互作，最后是生長素濃度。

表3 鉀水平和生長素濃度對植株各部位鉀素濃度影響的方差分析Table 3 Variance analysis of potassium level and auxin concentration on potassium concentration in various parts of plants

如圖4所示，無論是在根系還是葉片中，正常供鉀條件下其鉀素濃度均顯著高于低鉀水平 (P〈 0.05)。在根系中，隨著生長素濃度的增加，正常供鉀植株根系鉀素濃度表現為持續降低趨勢；低鉀植株根系鉀素濃度表現為先增加后降低的趨勢，其中在生長素濃度為10 μmol/L時達到最大值14.21 mg/g且與其他處理差異達到顯著水平。在葉片中，正常供鉀條件下，當生長素濃度為0～10 μmol/L時，其鉀素濃度變化不大，在生長素濃度為10～20 μmol/L時，其鉀素濃度迅速降低，之后隨著生長素濃度的增加，其鉀素濃度又緩慢升高；而低鉀植株葉片鉀素濃度表現為先緩慢升高又緩慢降低的趨勢，其中在生長素濃度為10 μmol/L時達到峰值38.7 mg/g。

圖4 供鉀5 mmol/L和0.15 mmol/L水平下外源生長素處理植株根系和葉片鉀濃度Fig. 4 Potassium concentration in various parts of plants treated with exogenous auxin under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

2.2.2 植株根系鉀吸收動力學特征差異 根系鉀吸收動力學參數Vmax和Km用來定量表征根系吸鉀特征，Vmax表示植物對鉀離子的最大吸收速率，其值越大，表示植株對鉀離子的吸收能力越強[20]；Km表示植株對鉀離子的親和力，其值越大，親和力越低[21]。在測定各部位鉀素濃度的基礎上，進一步研究了煙株根系對鉀素吸收的動力學參數。結果表明 (表4)，正常供鉀水平下根系動力學參數值均明顯高于低鉀水平。隨著生長素濃度的升高，正常供鉀和低鉀條件下根系Vmax均表現為先升高后降低的趨勢，其中正常供鉀在生長素濃度為5 μmol/L時達到峰值，為不添加生長素處理的2.26倍，低鉀在生長素濃度為10 μmol/L時達到峰值，為不添加生長素處理的1.94倍，且差異達到顯著水平 (P〈 0.05)；Km在正常供鉀時表現為持續降低趨勢，在低鉀時表現為先降低后升高的趨勢，在生長素濃度為10 μmol/L時達到最小值。

表4 植株根系鉀吸收動力學特征差異Table 4 Difference of kinetics of potassium absorption in plant root

2.2.3 植株體內相關鉀離子通道基因表達量檢測從圖5-a, b可知，NKT2基因在植株根系中的表達量整體高于葉片，且低鉀水平下NKT2基因的表達量普遍高于正常供鉀水平，隨著生長素濃度的提高，根系和葉片中基因NKT2的表達量整體呈現先增加后降低的趨勢。在根系中，正常供鉀和低鉀條件下，NKT2基因的表達量均在外源生長素濃度為10 μmol/L時達到峰值，其中此時低鉀條件下NKT2基因的表達量相對于低鉀無添加生長素增加了6.83倍，顯著高于其他各處理。葉片中，正常供鉀條件下NKT2基因的表達量在生長素濃度為10 μmol/L時達到最大值；低鉀條件下在生長素濃度為5 μmol/L時達到最大值，且顯著高于其余各處理 (P〈 0.05)。

從圖5-c, d可知，隨著生長素濃度的增加，根系和葉片中NtKC1基因的表達量整體表現為先增加后降低的趨勢。在根系中，正常供鉀水平下各處理NtKC1基因的表達量均高于相應低鉀水平；相對于正常供鉀無添加生長素處理，低鉀水平下各處理該基因的表達量均降低。正常供鉀條件下，NtKC1基因的表達量在生長素濃度為20 μmol/L時達到最大值；低鉀條件下在生長素濃度為10 μmol/L時其值最高。在葉片中，正常供鉀條件下，在生長素濃度為10 μmol/L時NtKC1基因的表達量與無添加生長素時水平相當，生長素濃度為20 μmol/L時NtKC1基因表達量最高；低鉀條件下，NtKC1表達量在生長素濃度為10 μmol/L時達到最大值。

Ntork1屬于外流型鉀離子通道基因。從圖5-e,f可知，無論是根系還是葉片，正常供鉀水平下各處理Ntork1基因的表達量均高于低鉀水平各相應處理，且相對于正常供鉀無添加生長素處理，低鉀水平下植株Ntork1基因的表達量均降低；隨著生長素濃度的升高，根系和葉片中Ntork1基因的表達量整體呈現先降低后增加的趨勢，且無論正常供鉀或是低鉀，該基因的表達量均在生長素濃度為10 μmol/L時達到最低值同時差異達到顯著性 (P〈 0.05)。

3 討論

3.1 外源生長素對不同鉀水平下植株根系生長及各部位內源生長素濃度的影響

根系是植物吸收礦質營養元素的主要部位，研究表明，外界供鉀水平的高低顯著影響煙株根系及地上部生長發育和干物質累積。在正常供鉀水平下各組織干物質累積量高于低鉀水平，說明低鉀脅迫影響干物質在植株中的累積，不利于根系的發育，這與代曉燕等[22-23]的研究結果一致。洪麗芳等[11]、代曉燕等[24]、劉世亮等[25]研究表明，打頂后葉面外施植物生長調節劑或生長素類物質可增加煙葉干物質累積量，這與本試驗中不同供鉀水平下添加外源生長素改善煙株生長狀況的結果相一致。此外，本試驗還發現，在正常供鉀和低鉀條件下，當添加外源生長素濃度為10 μmol/L時，可明顯提高煙株根系及地上部干物質重，改善煙株生長發育狀況。這說明通過根系添加生長素類物質也可調控植株根系生長，與以前研究發現打頂時葉面外施生長素的作用一致。

植物根系結構的可塑性 (尤其是側根) 是植物進化過程中對根際環境脅迫的一種適應機制。植物在面臨各種根際環境時會持續地改變其根系構型，主要是側根的數量和長度。Dubrovsky等[26]發現當擬南芥根系維管柱細胞生長素濃度降低時，擬南芥側根的萌發和伸長都受到抑制。研究表明，擬南芥在低鉀脅迫下，根系的生長會發生變化，而這與低鉀脅迫下植物激素的變化有關，根系中大量累積的生長素抑制植物主根生長[9]，這與本試驗中低鉀脅迫條件下根系的發育狀況一致，WinRHIZO軟件分析也表明正常供鉀水平各項指標數值均顯著高于低鉀水平處理，說明低鉀脅迫在一定程度上抑制了根系的伸長，不利于根系的生長發育。但是其中在外源生長素濃度為20 μmol/L時，正常供鉀與低鉀條件下植株根系各項掃描指標與根系干重表現出相矛盾的關系，研究認為這種情況可能是由于低鉀條件下，添加特定濃度的生長素可能會影響植株內部某種機制，從而對低鉀植株的干物質累積量及含水率有影響，雖然根系掃描各指標值較低，但其干物質積累量卻不少。對于這種特殊情況也是以后工作中我們需要繼續探討和有待于證實的問題。在低鉀條件下，施加生長素濃度為10 μmol/L時根系的長度、根尖數和根交疊數達到峰值，說明外施一定濃度的生長素濃度能夠緩解低鉀脅迫，有利于根系伸長，并增加側根數量，增大根系體積和吸收面積。

圖5 供鉀5和0.15 mmol/L水平下外源生長素處理的煙草植株鉀離子通道基因相對表達量Fig. 5 Relative expression levels of potassium channel genes in exogenous auxin-treated tobacco plants under treatments of K 5 and 0.15 mmol/L

根系活力表征根系的代謝狀況，是反映根系吸收營養元素和水分的重要指標，根系活力愈強，代表根系吸收能力越強，提供給植株地上部的養分和水分也越多[27]。本試驗研究證明，在不添加生長素時，正常供鉀植株根系活力值高于低鉀植株。低鉀水平下，通過添加適當濃度的生長素可提高根系活力，提高根系的鉀素吸收能力。根系ATP酶的活性影響質子跨膜運輸，進而影響植株根系對礦質養分的吸收，是表示根系代謝強度的重要指標[28]。楊鐵釗等[15]研究表明，低鉀脅迫條件下可降低植株根系ATP酶的活性，不利于質子跨膜運輸，對養分的吸收產生阻礙作用，本試驗結果與其一致，在低鉀條件下，根系ATP酶的活性顯著低于正常供鉀水平 (P〈0.05)。但是，在添加不同濃度的外源生長素以后，低鉀根系ATP酶的活性反而高于相應正常供鉀水平，且在生長素濃度為10 μmol/L時酶活性最高，說明在低鉀條件下可通過適當添加外源生長素來改善根系ATP酶的活性，進而調控植物根系對礦質養分的吸收。根系可溶性蛋白主要由根系中的酶組成，可溶性蛋白含量增加是根系活性增強的基礎。從根系可溶性蛋白含量上來看，低鉀條件下可溶性蛋白含量整體高于常規供鉀處理，說明低鉀脅迫仍可刺激根系的代謝活動。其中正常供鉀植株在生長素濃度為10 μmol/L時可溶性蛋白含量達到最大值，低鉀植株在生長素濃度為5 μmol/L時達到最大值，且差異達到顯著水平。綜合而言，低鉀脅迫可刺激植株根系中可溶性蛋白含量的增加，且無論正常供鉀還是低鉀情況下，外源添加生長素對植株根系可溶性蛋白含量均有一定的改善作用。

Ma等[29]在進行低鉀脅迫下水稻轉錄組分析中發現，在33個植物激素中有22個與生長素相關的基因發生了顯著變化，以上這些研究都說明在植物中生長素和鉀素營養有著關聯。鉀素水平影響植物體內生長素的分布，在不同鉀素水平下煙株體內生長素的分布也表現出一定的規律性。本試驗中，無論是主根尖、側根尖還是葉片中，添加不同濃度外源生長素后，低鉀植株內源生長素濃度整體高于相應正常供鉀條件，說明低鉀脅迫可刺激植物激素生長素的合成，促進各部位對生長素的累積。添加外源生長素以后，低鉀植株主根尖及側根尖內源生長素濃度在外源生長素濃度為0～20 μmol/L范圍內變化不大；葉片內源生長素濃度在外源生長素濃度為10 μmol/L時達到最小值，同時與正常供鉀無添加生長素達到相同水平，說明低鉀條件下過高的內源生長素濃度可能抑制了葉片及植株的生長，添加一定濃度的外源生長素以后，在一定程度上緩解了高濃度的抑制作用，促進煙株生長發育，這與上面研究一系列結果基本一致。正常供鉀水平下添加外源生長素以后，除了葉片內源生長素有略微降低趨勢以外，其余部位內源生長素濃度均增加。所以在正常供鉀和低鉀水平下，適當添加外源生長素可增加相應部位內源生長素濃度，促進植株生長發育。

3.2 外源生長素對不同鉀水平下植株體內鉀素吸收的影響

代曉燕等[24]和洪麗芳等[11]研究表明，打頂后在煙株頂端涂抹生長素也能夠提高煙草葉內的鉀素含量，其是在頂端調控條件下進行，本試驗采用根系調控的方法與其得出相同的結論。研究發現，低鉀條件下施加生長素濃度為10 μmol/L時，根系和葉片鉀素濃度均達到最大值，說明低鉀條件下通過適當添加外源生長素可以提高煙株整株的鉀含量，而生長素同樣也影響著煙株鉀素的累積分布。而在正常供鉀條件下，施加外源生長素以后，根系和葉片中的鉀素濃度均表現為不同程度的降低，這可能與其內源生長素濃度的變化有關，其機理還需進一步研究探討。

用根系鉀吸收動力學參數更能進一步定量描述植株根系對養分的吸收情況。Vmax值越大，表示植株對鉀離子的吸收速率越大，對鉀離子的吸收能力越強，Km越小，表示對鉀離子的親和力越高。結果表明 (表4)，正常供鉀情況下，在生長素濃度為5 μmol/L時，煙株的Vmax表現最大，高達生長素濃度為0 μmol/L時的2.26倍；Km則表現為持續降低趨勢，這可能是由于苗齡的影響。低鉀情況下，當生長素濃度為10 μmol/L時煙株Vmax值最大而Km值最小，表示對鉀離子的吸收和親和力最強。由上可知，無論正常供鉀還是低鉀條件下，施加適當濃度的生長素可以提高植株對鉀離子的吸收能力，進而提高植株鉀含量。

同時，本研究進一步分析了煙草相關的鉀離子吸收轉運關鍵基因NKT2、NtKC1、Ntork1的表達情況。NKT2主要負責參與轉運K+的作用，它能調控韌皮部細胞膜電壓，和NKT1基因一起分擔葉內細胞K+的滲透。本試驗中，無論根系還是葉片，低鉀水平下NKT2的相對表達量整體高于正常供鉀水平下。正常供鉀水平下，在外源生長素濃度為10 μmol/L時，根系和葉片中NKT2的相對表達量最高，說明適當添加了生長素后對提高鉀素的運輸來說還是有利的，低鉀條件下也幾乎符合此規律。擬南芥中的AtKC1基因主要在根毛區和根的內皮層中表達，是根毛鉀離子吸收通道的重要組成單位，本試驗中，正常供鉀情況下在外源生長素濃度為20 μmol/L時各部位NtKC1的相對表達量最高，而低鉀情況下在外源生長素濃度為10 μmol/L最高，說明在不同的鉀水平下，可添加不同的生長素來提高根系鉀素運輸。Ntork1基因主要在葉片保衛細胞和根表皮木質部薄壁細胞中表達，屬于外流型鉀離子通道，本試驗中無論正常供鉀還是低鉀，其表達量均在外源生長素濃度為10 μmol/L的最低，因為其屬于外流型鉀離子通道，所以說明在正常和低鉀條件下添加10 μmol/L的外源生長素可有效抑制鉀離子的外流，從而提供煙株體內鉀離子濃度。

植物對K+的吸收通過高親和系統[低外部K+濃度(1～200 μmol/L)，通過鉀轉運蛋白主動運輸]和低親和系統[高外部K+濃度 (1～10 mmol/L)，通過鉀離子通道被動運輸]進行。本試驗主要研究低鉀脅迫即高親和系統，鉀離子通道是鉀離子吸收的其中一個途徑。孫小茗[30]研究表明，在外源K+濃度為5 mmol/L時，將通道抑制后，K+的跨細胞膜轉移過程有很大一部分是通過載體蛋白組成的高親和轉運系統來完成的。其研究發現，當同時添加通道抑制劑TEA和載體抑制劑NEM后，植物仍然可以吸收部分鉀，而且這種情況隨介質中鉀離子濃度的增加而更趨明顯，這種途徑很可能就是非選擇性離子通道 (NSCCs)[31-32]。說明植株對鉀離子的吸收不只是局限于已知的兩種機制，且目前對于煙草鉀轉運蛋白的研究較少，尚不成熟，而對鉀離子通道的研究日趨完善，所以本試驗對鉀離子通道的測定研究具有一定的參考價值和研究意義。

4 結論

1) 在未添加外源生長素條件下，與正常供鉀處理相比，低鉀脅迫可明顯抑制植株根系生長發育及對鉀素的吸收累積。

2) 當施用外源生長素以后，隨著生長素濃度的升高，正常供鉀和低鉀植株的根系干重、根系活力、主根尖及側根尖內源生長素濃度均有增加的趨勢，且鉀吸收動力學參數Vmax值和NKT2和NtKC1的表達量明顯增加。其中低鉀植株根系生長狀況明顯改善，地上地下部鉀素濃度提高，Ntork1的表達量降低。

3) 無論正常供鉀或是低鉀，當添加外源生長素濃度為10 μmol/L時，可明顯改善植株根系的生長發育，提高內流型通道基因NKT2和NtKC1的表達量，降低外流型通道基因Ntork1的表達量，提高煙株對鉀離子的吸收能力與親和力，從而增加植株鉀含量。