流感病毒與腸道菌群的相互作用對感染結局的影響

劉雨琪，朱俊萍※，何秋水,2※

(1.首都醫科大學基礎醫學院病原生物學系，北京100069； 2.芬蘭圖爾庫大學醫學微生物學和免疫學系，西芬蘭 圖爾庫 20520)

流感病毒是一種嚴重威脅全球人類健康的呼吸道病毒。1918年的“西班牙大流感”(H1N1)在1918—1919年不到兩年的時間里蔓延全球，造成了數千萬患者的死亡，其中青壯年人死亡為主要特征，流感病毒感染后繼發的細菌性肺炎可能是造成死亡的主要原因[1]。而這一現象在H2N2“亞洲流感”(1957—1958年)和H3N2“香港流感”(1968—1969年)暴發中也有發現。一些呼吸道常見細菌，如肺炎球菌、溶血性鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、金黃色葡萄球菌以及流感嗜血桿菌等為“西班牙流感”中繼發細菌性感染的主要成員[2]。流感大暴發通常呈周期性出現，而季節性流感則每年可致300萬～500萬重癥患者，以及25萬～50萬的患者死亡[3]。新近研究數據發布，自1999—2015年，每年有291 243～645 832人死于流感病毒相關的呼吸道疾病[4]。在人群中引起高發病率和死亡率的主要是人類甲型流感病毒和乙型流感病毒，以在中老年人群以及存在免疫缺陷的患者中更為突出[5]。僅甲型流感病毒，平均每年可感染全球5%～10%的成年人以及20%～30%的兒童[6]。20世紀以來，中國也曾多次暴發全國范圍的大型流感疫情，涉及甲型H1N1、H3N2、H7N9、乙型流感病毒等多種亞型，目前已形成多種亞型共同流行的趨勢。探究流感病毒作用于機體免疫系統的機制以及牽涉抗病毒免疫應答的腸道菌群與流感病毒的相互作用對于流感防治新策略的制訂和優化有重要意義。現就流感病毒與腸道菌群的相互作用對感染結局的影響進行綜述。

1 流感病毒概述

流感病毒是一種有包膜的負鏈RNA病毒，為正黏病毒科成員，主要通過呼吸道傳播。病毒感染呼吸道黏膜細胞，造成局部損傷，具有傳染性強、發病率高、抗原變異快等特點[7-8]。流感病毒感染主要引起發熱、咳嗽、咽炎、疲憊、肌肉痛等癥狀，患者常伴有腸道功能失調，病情嚴重者可能致死且兒童更容易發病[8]。流感之所以每年反復發生，取決于流感病毒獨特的結構及分節段的RNA遺傳物質的快速變異[9]。流感病毒RNA轉錄和復制過程相關的聚合酶蛋白亞基中發生的大量突變可導致病毒宿主范圍擴大和病毒致病性的增強[10]。流感病毒一般不入血形成病毒血癥，且本身對宿主細胞的致病效應不強，但其可影響機體免疫應答，引起不同類型淋巴細胞數量改變以及相應細胞因子的產生，導致全身反應和嚴重的免疫病理損傷[11-12]。黏膜免疫在流感病毒感染及抗感染過程中發揮重要作用。

2 腸道菌群及其對黏膜免疫的影響

腸道菌群是人類腸道中的正常微生物群，細菌總數可達100萬億，遠遠超過人體自身的細胞數量，而腸道菌群的總質量可達1.5 kg[13]。已經發現定植于腸道的細菌可達上千種[14]，主要分屬4個菌門：擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，其中擬桿菌門和厚壁菌門為優勢菌門[15-16]。根據腸道菌群與宿主的關系可分為共生菌、條件致病菌和致病菌3類。其中共生菌是與宿主存在共生關系的生理性細菌，條件致病菌只在機體免疫功能低下時有致病作用，病原菌會在腸道菌群失調時大量定植并引起疾病。腸道菌群在維持機體健康方面發揮重要作用,其可調節機體的免疫應答、競爭性抑制病原菌定植、誘導機體產生對共生菌的免疫耐受、維持腸道內環境的穩定并幫助免疫系統發育成熟，同時還可以分解及合成營養物質供機體吸收利用等[3,17]。研究發現，飲食、居住環境、抗生素使用、病毒感染等因素均可影響個體腸道菌群的組成[18-19]。

腸道菌群不僅能調節機體對腸道內病原體的免疫應答，還可影響腸道外其他部位發生的病毒感染[8]。細菌可通過自身結構成分或其代謝產物進入循環系統影響腸道外的環境，如革蘭陰性菌的細胞壁成分脂多糖和細菌代謝產物短鏈脂肪酸對免疫系統的重要調節作用已被證明[18]。短鏈脂肪酸是腸細胞的能量來源之一，能激活黏蛋白，增強腸道黏膜屏障的完整性，影響腸道黏膜免疫系統的免疫調節作用[20]。短鏈脂肪酸也可激活炎癥小體，上調白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-10的表達。有研究表明嗜酸乳桿菌L-92、鼠李糖乳桿菌GG等益生菌會加強這種上調效應，增強機體的抗病毒能力及免疫保護作用[21-22]。此外,短鏈脂肪酸通過激活適應性免疫應答提高機體對病毒及其他病原體的清除能力，實現抗病毒免疫的正向調節[3,16]。可見,腸道菌群及其代謝產物在病毒感染和機體免疫調節中均發揮重要作用。腸道菌群還能通過模式識別受體調節參與炎癥反應的基因表達以及抗菌肽的產生[23]。腸道菌群失調可改變不同淋巴細胞亞群的比例以及炎癥細胞因子的分泌，誘導免疫負調節作用[24]。目前研究表明，腸道菌群與呼吸道病毒感染之間聯系密切，且可通過“腸-肺軸”影響相關疾病的發生、發展[25]。在流感病毒感染的個體中，腸道菌群的改變能夠影響宿主抗體反應和病毒特異性CD4+T細胞、CD8+T細胞的功能，還能通過適當激活炎癥細胞因子分泌在呼吸道黏膜的免疫調節中發揮作用[26-27]。

3 流感病毒與腸道菌群的相互作用

3.1流感病毒感染對腸道菌群組成的影響 正常情況下，人體內的微生物與宿主處于相對穩定的動態平衡，但病毒感染等因素會破壞這種平衡[19]。臨床研究發現，流感患者常伴有腸道功能紊亂與失調[27]。多項研究表明，在動物和人體中，流感病毒感染均能引起呼吸道和腸道菌群的改變,破壞宿主-微生物穩態[25,28-29]。甲型流感病毒通過感染人的呼吸道致病，而在自然水禽宿主中主要感染胃腸道，致病性小并且通過糞口傳播。研究發現，流感病毒H1N1感染綠頭鴨后泄殖腔菌群豐度下降，其中厚壁菌門數量減少，變形菌門與擬桿菌門的數量增加[28]。與對照組相比，感染H9N2的雞泄殖腔菌群中變形菌門數量增多，而雙歧桿菌豐度降低[29]。Bartley等[30]研究年齡、飲食等因素對流感病毒感染后所發生的菌群改變的影響，發現年齡對小鼠腸道菌群門類變化的影響不大，但流感病毒感染及飲食因素均對腸道菌群組成有明顯。有研究發現，H1N1感染小鼠的糞便中菌群多樣性顯著改變，其中擬桿菌門與厚壁菌門的比例升高[18]。而流感病毒FM1株感染的小鼠腸道中，腸桿菌科、腸球菌等致病菌數量增加，乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌數量減少[31]。流感病毒PR8株感染的小鼠腸道中分節絲狀菌數量減少，擬桿菌屬總量基本不變[32]，變形菌門數量增加，專性厭氧菌數量減少[30](表1)。總之，流感病毒感染小鼠后通常導致腸道菌群中腸桿菌數量增多,乳桿菌和分節絲狀菌數量減少，且在流感病毒感染后，肺部CC趨化因子受體9(C-C chemokine receptor 9,CCR9)+CD4+T細胞可被募集至腸組織，CD4+T細胞產生γ干擾素，同時腸道菌群組成改變，黏膜免疫功能失調，其中大腸埃希菌的增加導致腸上皮細胞分泌IL-15水平增高，促進CD4+T細胞原位分化為Th17細胞，引起腸損傷[32，35]。

同時，Deriu等[36]研究發現，小鼠模型中流感病毒感染引起的腸道菌群失調會促進沙門菌的二次感染，而人患流感并發生高死亡率的主要危險因素之一是繼發細菌性肺炎[37]。在甲型流感病毒感染的人群中，成人常伴發金黃色葡萄球菌混合感染，而兒童常出現肺炎球菌混合感染[38]。Loughran等[39]研究發現，甲型流感病毒感染可直接抑制人體對肺炎球菌的免疫應答。體外實驗發現，流感病毒(H1N1和H2N3)和高溫殺滅的肺炎球菌共孵育人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)，相較單獨的肺炎鏈球菌感染組PBMCs 分泌IL-23、IL-17、γ干擾素水平降低，IL-1β 和IL-10水平無明顯變化，而H2N3組的PBMCs 分泌IL-6水平也下降。已知IL-17對肺炎球菌感染中病原的清除十分關鍵，而且證實IL-17應答下調部分原因是由流感病毒的血凝素成分導致。與健康人腸道菌群相比，H7N9感染者雙歧桿菌/腸桿菌比值下降[3]。Qin等[40]分析了26例H7N9感染者的腸道菌群組成，發現無論是H7N9感染者還是未經感染者，腸道中都是擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門數量占優勢，但與未感染人群相比，H7N9感染者中擬桿菌門數量下降，變形菌門數量增多；其中，感染者的雙歧桿菌數量減少，沙門菌、大腸埃希菌和腸球菌數量增加。由此可見，H7N9感染者相較于未感染者腸道菌群組成不穩定，益生菌數量減少而致病菌數量增加。Yu等[41]體外分離培養流感病毒感染者(n=155)與健康人(n=145)的PBMCs，發現病毒刺激后感染者PBMCs分泌IL-22和IL-34水平增高。兩種細胞因子均由Th17細胞分泌，但其分泌細胞分屬不同亞類。該研究發現IL-34表達上調是由IL-22的上調所致，而IL-34則可反饋抑制IL-22的表達(表2)。已知IL-22的受體廣泛分布于肺、腸等上皮組織細胞，研究發現芳香族化合物受體/IL-22/信號轉導及轉錄激活因子信號通路可參與小鼠腸道共生菌產生的抗菌分子(包括溶菌酶、RC型凝集素RegⅢγ 和隱窩素5 mRNA等)產量的調節，從而影響腸黏膜屏障的功能[44-45]。

表1 動物實驗中流感病毒感染引起的腸道菌群變化及相關免疫反應

IEL：上皮內淋巴細胞；LPL：固有層淋巴細胞；IEC：小腸黏膜上皮細胞；IL：白細胞介素；Th：輔助性T細胞；IFN-γ：γ干擾素；↑：數量增加/表達上調；↓：數量減少/表達下調；-：文獻中無相關數據

表2 流感病毒感染引起人的腸道菌群變化及相關免疫反應

IAV：甲型流感病毒；PBMCs: 外周血單個核細胞；HSKP：高溫殺滅的肺炎球菌IL：白細胞介素；IFN-γ：γ干擾素；↑；數量增加/表達上調；↓：數量減少/表達下調；-：文獻中無相關數據

3.2腸道菌群對流感病毒感染的影響 研究發現，只有當病毒感染小鼠呼吸道并出現肺部損傷時才會引起嚴重的腸道免疫損傷[32]。腸損傷的發生并非病毒直接感染腸道上皮細胞引起，而是由病毒感染呼吸道上皮細胞導致呼吸道黏膜淋巴細胞在趨化因子配體1-CCR9趨化因子軸的作用下遷移至腸道黏膜，從而改變腸道微生物組成及穩態，最終引起腸道免疫損傷。有研究通過分離小腸黏膜上皮細胞、固有層淋巴細胞和上皮內淋巴細胞進行染色測定各類細胞內細胞因子的表達量，結果發現，H1N1病毒PR8株感染后，小鼠肺部CD4+T細胞的γ干擾素表達水平顯著升高，且腸道菌群組成相應發生改變；但γ干擾素表達量低時，病毒感染小鼠的腸道免疫損傷減輕,IL-17表達水平正常,腸道菌群組成未發生改變[32]。由此可見，肺源性的效應細胞CD4+T細胞可能通過過量分泌γ干擾素干擾腸道微生物群的穩態，導致腸道菌群失調[32]。在流感病毒感染的小鼠中，除發生肺源性CCR9+CD4+T細胞的招募及其分泌γ干擾素介導腸道菌群組成變化并引起腸道免疫損傷外，腸道菌群變化還可誘導小腸上皮細胞產生IL-15，直接或間接刺激小腸本身的Th17細胞發生極化。但IL-15對Th17細胞的作用仍存在爭議，推測其對Th17細胞生成有促進和抑制雙重作用[32]。

γ干擾素在流感病毒感染過程中發揮重要作用。流感病毒H1N1的CA04株感染小鼠模型中，通過檢測肺泡灌洗液中的細胞因子水平發現γ干擾素的產生可增加機體對流感病毒的易感性。流感病毒感染引起小鼠肺部γ干擾素分泌增加，作用于2型固有淋巴細胞表面的γ干擾素受體，導致肺部2型固有淋巴細胞活性減弱，IL-5分泌減少，可能影響肺部上皮組織的完整性，導致機體對流感病毒的抵抗力下降[33]。2型固有淋巴細胞在黏膜免疫中發揮重要作用，尤其在肺部，除分泌IL-5外，還能產生IL-13和雙調蛋白，雙調蛋白是一種與表皮生長因子家族同源的雙功能生長調節蛋白。流感病毒感染的小鼠中，呼吸道黏膜屏障中的內皮細胞、上皮細胞和巨噬細胞表達IL-33，誘導2型固有淋巴細胞分泌IL-13，并刺激其表達雙調蛋白。IL-33是黏膜屏障的保護性因子，其分泌量減少會增加小鼠繼發細菌性感染的概率[34](表1)。由于全身的黏膜免疫系統相互聯系，流感病毒感染時，肺與腸的黏膜免疫反應都涉及γ干擾素的分泌增多，在肺與腸道黏膜免疫中是否存在相似的調節機制尚不清楚。除CD4+T細胞外，其他細胞是否也存在遷移現象，以及流感疾病過程中2型固有淋巴細胞是否對腸道黏膜免疫產生影響尚不明確。

腸道菌群改變可通過免疫途徑間接影響流感病毒感染。利用抗生素處理動物，構建菌群紊亂模型，可以研究腸道菌群對流感病毒感染的影響。吳莎等[26]將正常小鼠經甲硝唑灌胃后，用總厭氧菌培養基腦心浸液瓊脂分離檢測后發現，小鼠腸道中總厭氧菌數量下降。隨后在建立的厭氧菌菌群失調小鼠模型中發現，厭氧菌失調會導致Th1、Th2、Th17、調節性T細胞比例的變化。H1N1病毒FM1株感染小鼠肺組織勻漿中γ干擾素、IL-17水平升高，IL-4、IL-10水平降低，此時Th1、Th17細胞因子分泌占優勢。甲硝唑處理后再經流感病毒感染的小鼠相較于單純病毒感染小鼠表現為IL-4、IL-10水平升高，γ干擾素、IL-17水平顯著降低。而患者外周血中IL-6與IL-10水平增高，可能與流感病毒感染的病程進展和病情加重有關[42-43]。Th2細胞、調節性T細胞因子分泌優勢主要是菌群失調引起免疫負向調節作用，而各細胞因子的變化可能影響流感病毒從機體的清除從而加重病毒感染后的免疫病理損傷[26，42-43](表2)。Yu等[24]研究發現，經不同種類抗生素處理的小鼠，在感染流感病毒后，腸道菌群組成及脾臟中不同種類CD4+T 細胞數量變化不同。病毒感染對Th1、Th2細胞占比并無太大影響，Th1、Th2細胞的占比主要受腸道菌群調節，但腸道菌群變化對Th17細胞占比影響不大。然而，Wang等[32]研究發現，將流感病毒H1N1的PR8株感染小鼠的腸道菌群移植到對照組小鼠體內，則對照小鼠體內IL-17表達增多，可見病毒感染誘導的腸道菌群改變可以促進Th17細胞的分化以及相應細胞因子的產生。流感病毒感染對Th17細胞數量變化的影響機制仍待進一步闡明。相較于單純流感病毒感染小鼠，抗生素處理后再經感病毒感染的小鼠固有免疫與適應性免疫應答減弱，肺部CD4+T細胞和 CD8+T 細胞數量減少，肺泡中巨噬細胞抗病毒基因表達降低，血液中病毒載量增加[27](表1)。在感染H7N9流感病毒的患者中也存在類似現象[40]。可見，抗生素處理后的菌群失調會降低機體的抗病毒免疫應答，從而加重流感病毒感染后造成的肺損傷。Steed等[46]研究發現腸道菌群代謝產物脫氨基酪氨酸也能影響流感病毒感染。經去氨基酪氨酸處理的小鼠肺部干擾素刺激基因表達增加。敲除 Irgm1-/-的高表達Ⅰ型干擾素的小鼠，流感病毒感染后造成的死亡率降低。與對照組小鼠相比，去氨基酪氨酸治療組小鼠流感相關的死亡率顯著降低，推測感染前去氨基酪氨酸通過增強Ⅰ型干擾素釋放，實現了對流感病毒H1N1感染的部分抵抗。

另一方面，腸道菌群中的益生菌在抗流感病毒感染中發揮積極作用。益生菌可通過調節固有免疫，維持腸壁的完整性，激活適應性免疫應答，增強機體的抗病毒能力[47]。目前，益生菌在病毒感染防治中的研究越來越多，Belkacem等[48]研究發現，副干酪乳桿菌可通過改變炎癥細胞因子的釋放調節機體的炎癥反應狀態。接種流感病毒前，用副干酪乳桿菌飼喂小鼠，能預激免疫系統和促炎因子釋放，在流感病毒感染后，IL-33分泌增加，激活Th2細胞產生IL-13，促進上皮細胞增生，隨后抗炎因子IL-10分泌增加，降低炎癥反應，從而避免過度炎癥反應導致機體的免疫病理損傷[48]。

目前多數研究仍集中在腸道菌群變化與機體抗流感病毒免疫應答的關系方面，但Bandoro和Runstadler[49]的研究提示腸道菌群還可與流感病毒發生直接作用。已知健康人體的肺部菌群和野鴨泄殖腔菌群都是以厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為主。選取包括這三大主要菌門和疣微菌門中13種來源腸道菌群的代表性細菌，在野鴨流感模型中研究其是否直接對流感病毒穩定性產生影響，結果發現其中11種細菌對流感病毒的穩定性產生不同程度的影響。初步推測腸道細菌可直接作用于流感病毒或通過其代謝產物的間接作用降低流感病毒的穩定性。已有研究發現腸道菌群及細菌細胞壁成分脂多糖可通過直接作用促進人脊髓灰質炎病毒和鼠乳腺腫瘤病毒的致病性[50-51]。而該動物實驗中發現腸道菌群可降低流感病毒在小鼠中的致病性，并且進一步確認了脂多糖能夠以溫度依賴方式和濃度依賴方式(37 ℃)降低甲型流感病毒的持久生存能力和結構穩定性。進一步分析，不同亞型以及不同宿主來源的流感病毒與脂多糖互作的敏感性不同。如流感病毒在禽類的泄殖腔內可直接接觸腸道細菌及其細胞壁成分脂多糖，而流感病毒感染引發的腸道菌群失調則可能造成腸道黏膜屏障損壞，導致脂多糖泄露進入循環系統。在一定條件下，脂多糖可與病毒粒子結合影響流感病毒包膜的完整性，致使病毒形態變化，導致其傳染性下降[49]。

4 小 結

流感病毒感染人及動物宿主后均可引起腸道菌群組成改變，其中致病菌數量增加，益生菌數量減少。而腸道菌群失調又可降低宿主的抗病毒免疫應答，加重流感病毒感染后造成的肺損傷。目前,針對季節性流感病毒的疫苗是應對流感病毒感染的最佳對策。但疫苗只能誘導窄譜的毒株特異性免疫應答，對發生抗原變異的病毒株感染無交叉保護[52]。因此，疫苗必須隨流行毒株的變異而不斷更新。在流感病毒感染中出現的密切關聯的肺部與腸道的黏膜免疫反應，提示黏膜免疫系統的整體性在許多疾病的發生、發展中可能存在相似的作用機制。目前益生菌療法也可能對流感的治療及機體抗病毒免疫能力的提升發揮積極作用。Brundage[53]曾提出在流感大流行前可考慮進行細菌性疫苗的接種以及常見呼吸道病原菌敏感的廣譜抗生素的大量使用，以預防和減輕流感和細菌相互作用導致的嚴重后果。腸道菌群在流感病毒感染包括機體抗病毒應答中作用關鍵，廣譜抗生素的使用必須慎重且有針對性的選用。