一測多評法同時測定連翹揮發(fā)油中4種有效成分的含量Δ

吳婷，譚麗媛，王旭文，翟康欣，陳瑾，裴香萍，周永剛，張玉華，魏珊，張淑蓉#（.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬八一醫(yī)院藥學(xué)科，南京 000；.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西晉中 0069；.山西振東安特生物制藥有限公司，山西晉中 0069）

連翹為木犀科植物連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果實，具有清熱解毒、消腫散結(jié)等多種功效，是臨床常用的中藥材，常作為如小兒退熱顆粒、抗病毒口服液、雙黃連制劑等中成藥的主要組成藥味[1-2]。連翹果實含有豐富的揮發(fā)油，其揮發(fā)油中的有效成分主要包括α-蒎烯、β-蒎烯等，具有廣譜的抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[3-7]。目前對連翹揮發(fā)油進行含量測定的方法多為外標(biāo)法（ESM）和內(nèi)標(biāo)法[5-6，8-9]，但上述方法在對大批量連翹揮發(fā)油進行多指標(biāo)含量測定時，常由于對照品貨源不足或價格昂貴，使得其實際應(yīng)用受限?；诖?，為大幅度降低連翹藥材質(zhì)量控制的成本，提高其檢測效率，本研究以連翹揮發(fā)油的主要成分之一，即結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定、價格相對低廉的檸檬烯作為內(nèi)參物，采用一測多評法（QAMS）同時測定連翹揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯和α-松油醇等4個有效成分的含量，并與外標(biāo)法測定結(jié)果進行比較，為連翹藥材及相應(yīng)制劑的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)提升提供方法基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

FA224型電子分析天平（萬分之一，上海舜宇平科學(xué)儀器有限公司）；AB135-S型電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）；7890A型氣相色譜儀、4890D型氣相色譜儀、HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）均購自美國Agilent公司。

1.2 藥品與試劑

α-蒎烯對照品（批號：P110875，純度：＞98%）、β-蒎烯對照品（批號：P108923，純度：＞98%）均購自上海阿拉丁試劑有限公司；檸檬烯對照品（批號：IC01ZA，純度：＞95.0%）、α-松油醇對照品（批號：IC02ZA，純度：＞95.0%）購自上海梯希愛化成工業(yè)有限公司；乙酸乙酯、無水硫酸鈉等為優(yōu)級純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

16批連翹藥材分別采集于山西、河南、河北、陜西，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室裴香萍副教授鑒定，均為木犀科植物連翹[F.suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果實。藥材來源信息詳見表1。

表1 連翹藥材來源信息Tab 1 Sources of Forsythia suspensa

2 方法與結(jié)果

2.1 連翹揮發(fā)油中4種有效成分含量測定方法的建立

采用QAMS法以7890A型氣相色譜儀同步測定。

2.1.1 色譜條件 色譜柱：HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫（初始溫度50℃，以5℃/min的速率升至86℃，保持3 min；再以20℃/min的速率升至220℃，保持1 min）；進樣口溫度：230℃；檢測器溫度：250℃；分流進樣，分流比：8∶1；空氣流速：300 mL/min；氫氣流速：30 mL/min；尾吹氣流速：30 mL/min；進樣體積：1 μL；運行時間：17.9 min。

2.1.2 溶液制備 （1）供試品溶液：將連翹藥材粉碎成粗粉（60目），精密稱取粗粉100 g，置于圓底燒瓶中，加水700 mL浸泡30 min，用水蒸氣蒸餾法連續(xù)回流5 h提取揮發(fā)油；將收集到的揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥后，除去固體不溶物，精密稱定，4℃避光保存。精密稱取連翹揮發(fā)油16.90 mg，置于10 mL量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得，密封冷藏，備用。（2）混合對照品溶液：精密稱取α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-松油醇對照品各適量，置于同一10 mL量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度并搖勻，即得上述成分質(zhì)量濃度分別為2.64、6.10、1.31、0.38 mg/mL的混合對照品溶液，密封冷藏，備用。

2.1.3 專屬性試驗 分別精密量取空白溶劑（乙酸乙酯）、“2.1.2（2）”項下混合對照品溶液、供試品溶液（編號：S4）適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各成分的色譜峰均能達到基線分離，專屬性較好，詳見圖1。

2.1.4 線性關(guān)系考察 用微量移液器分別精密量取“2.1.2（2）”項下混合對照品溶液0.012 5、0.037 5、0.062 5、0.250 0、0.750 0 mL，置于2 mL量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，制成不同質(zhì)量濃度的系列線性混合對照品溶液。分別精密量取上述系列溶液1 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測物質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果，α-蒎烯的回歸方程為y＝2.223 6x+0.026 2（r＝0.999 3），其檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為16.5～990.0 μg/mL；β-蒎烯的回歸方程為 y＝2.176 7x+0.037 7（r＝0.9996），表明其檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為38.1～2 287.5 μg/mL；檸檬烯的回歸方程為y＝2.544 9x+0.016 4（r＝0.999 2），表明其檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為8.2～491.2 μg/mL；α-松油醇的回歸方程為y＝2.913 6x+0.092 9（r＝0.999 1），表明其檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為2.4～142.5 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗 精密量取“2.1.2（2）”項下混合對照品溶液0.062 5 mL，置于2 mL量瓶，用乙酸乙酯稀釋、定容，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-松油醇峰面積的RSD分別為0.56%、0.82%、2.48%、1.70%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同一批連翹藥材粗粉（編號：S4），精密稱定，平行操作6份，按“2.1.2（1）”項下方法提取揮發(fā)油并制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各待測成分的含量。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-松油醇的含量RSD分別為0.01%、2.54%、2.58%、2.06%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 連翹揮發(fā)油氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms of volatile oil from F.suspensa

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（編號：S4），分別于4 ℃冷藏條件下放置0、2、4、6、8、10 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-松油醇峰面積的RSD分別為1.73%、2.09%、1.00%、0.52%（n＝6），表明供試品溶液在4℃條件下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取連翹藥材粗粉（編號：S4），按“2.1.2（1）”項下方法提取連翹揮發(fā)油；稱取所得揮發(fā)油17 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，平行操作9份，分別精密加入“2.1.2（2）”項下混合對照品溶液適量，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各待測成分含量及加樣回收率。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-松油醇的平均回收率分別為101.6%、99.7%、105.5%、104.1%，RSD分別為1.28%、0.92%、3.54%、3.50%（n＝9），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.9 相對校正因子的計算 取同一批連翹藥材（編號：S4），精密稱定，平行操作3份，按“2.1.2（1）”項下方法提取連翹揮發(fā)油并制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以檸檬烯為內(nèi)參物，按公式計算其他各待測成分的相對校正因子：fk/si＝fk/fsi＝（Wk×Asi）/（Wsi×Ak）。式中，Ak為內(nèi)參物峰面積，Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量，Asi為其他i組分的峰面積，Wsi為其他i組分的質(zhì)量。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、α-松油醇的相對校正因子平均值分別為0.91、0.86、1.11（n＝3）。

2.2 相對校正因子和相對保留時間的重現(xiàn)性考察

2.2.1 不同色譜儀和不同色譜柱的考察 固定其他色譜條件不變，在兩套不同的色譜儀器系統(tǒng)（7890A型氣相色譜儀、4890D型氣相色譜儀）和兩種不同的色譜柱[HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）]條件下對相對校正因子進行考察，均平行操作6次。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、α-松油醇的相對校正因子的RSD為0.21%～4.65%（n＝6），表明上述3種成分與內(nèi)參物檸檬烯間相對校正因子的重現(xiàn)性良好。

2.2.2 待測組分色譜峰的定位 采用相對保留時間作為色譜峰定位標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合峰形即能夠正確判斷出目標(biāo)峰的準(zhǔn)確位置[10-12]，按“2.2.1”項下方法考察不同色譜儀和不同色譜柱條件下的重現(xiàn)性。結(jié)果，以檸檬烯為內(nèi)參物時，α-蒎烯、β-蒎烯、α-松油醇的相對保留時間分別為0.69～0.74、0.81～0.86、1.25～1.35，RSD 分 別 為 0.98% 、1.26%、2.69%（n＝6），表明上述3種成分與內(nèi)參物檸檬烯間相對保留時間重現(xiàn)性良好。

2.3 QAMS法與ESM法測定連翹揮發(fā)油中4種成分的結(jié)果比較

取16批連翹藥材粗粉，按“2.1.2（1）”項下方法提取連翹揮發(fā)油并制備供試品溶液。分別采用QAMS法和ESM法[5]，對α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-松油醇進行色譜峰定位及含量測定（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示），每批樣品均平行測定3次。將兩種方法測定結(jié)果進行比較，計算其相對誤差[RE，RE＝（含量QAMS法－含量ESM法）/含量ESM法×100%]，以驗證QAMS法的可靠性，詳見表2（注：表中RE值為“0.00”者均表示其絕對值小于0.01%；因檸檬烯作為內(nèi)參物，故其QAMS法與ESM法的測定結(jié)果數(shù)據(jù)相同，RE值略去）。由表2可見，兩種方法測定結(jié)果比較，α-蒎烯含量RE為－4.23%～－3.60%，β-蒎烯含量RE為－0.29%～－0.15%，α-松油醇含量RE為0.00%～6.27%。同時采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對兩種方法測定數(shù)據(jù)進行t檢驗比較后顯示，P值均大于0.05，提示這兩種方法的測定結(jié)果組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，建立的相對校正因子具有較好的可信度，因此QAMS法應(yīng)用于連翹揮發(fā)油多指標(biāo)成分的含量測定具有可行性。

表2 QAMS法和ESM法測定16批連翹藥材揮發(fā)油中4種成分平均含量的結(jié)果比較（n＝3）Tab 2 Comparison of average contents of 4 components in volatile oil from 16 batches of F.suspensa between QAMS and ESM（n＝3）

3 討論

本課題組前期分別對連翹揮發(fā)油提取過程中的藥材粉碎粒度、水用量、提取方法、提取壓力、提取溫度和提取時間等進行了正交試驗考察[5，8-9]，確定了本試驗中的揮發(fā)油提取方法；同時，對氣相色譜法的進樣分流比、樣品配制濃度及升溫程序等進行了考察，最終確定了本試驗的色譜條件。結(jié)果顯示，在本試驗色譜條件下，α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-松油醇等4種成分均能夠?qū)崿F(xiàn)完全分離，且峰形較好；線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度均良好，表明方法可靠。檸檬烯與其他3種成分間相對校正因子的RSD為0.21%～4.65%，表明所建立的QAMS法在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱條件下重現(xiàn)性均良好；同時，4種待測成分在不同儀器和色譜柱上出峰時間雖有所變化，但各成分的相對保留時間變化不大（RSD＜3%），因此采用相對保留時間進行成分色譜峰定位能較好地避免試驗條件變化對測定結(jié)果的干擾。

QAMS法的原理是通過中藥有效成分間存在的內(nèi)在比例關(guān)系，僅通過測定某一內(nèi)參物成分（內(nèi)參物要求其化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定、來源有保證、廉價易得）的含量來實現(xiàn)多個成分（相應(yīng)對照品缺失或價高難以持續(xù)供應(yīng)等）的同步定量分析[10]。因此，本研究選擇連翹揮發(fā)油成分中穩(wěn)定、價廉、易獲得的檸檬烯為內(nèi)參物，結(jié)果顯示其能夠準(zhǔn)確對α-蒎烯、β-蒎烯和α-松油醇進行色譜峰定位；且對這4種成分的含量測定結(jié)果顯示，QAMS法所測結(jié)果與傳統(tǒng)常用ESM法所得實測值基本一致，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明QAMS法用于連翹揮發(fā)油中多成分含量同步測定合理、可靠、重復(fù)性好，具有簡便、易操作、低成本的特點，能避免內(nèi)標(biāo)法需尋找內(nèi)標(biāo)物以及外標(biāo)法對照品不易獲得、操作相對繁瑣等缺點。

綜上，本研究建立的測定連翹揮發(fā)油中4種有效成分含量的QAMS法，可用于連翹藥材和相應(yīng)制劑的質(zhì)量控制，在未來中藥揮發(fā)油多指標(biāo)質(zhì)量評價中也有望得到更廣泛的應(yīng)用。