VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白在復發腦膠質瘤術后的表達及分析

羅赤星 全中平 張 銘 周 波 王少波 羅心凱 黃義志

腦膠質瘤是最常見的中樞神經系統腫瘤，約占顱內腫瘤的50%，且呈逐年上升趨勢[1]。腦膠質瘤患者目前治療主要采用手術、放射治療、化學藥物治療等綜合治療，但大部分患者首次治療后仍會出現腫瘤進展或復發，復發的主要原因在于腫瘤細胞不能完全手術清除，復發部位多在原部位，復發性膠質母細胞瘤預后極差，平均生存期1.0～4.5個月，術后復發為死亡主要原因，及時進行外科手術再切除為首選治療方案，是減少腫瘤細胞最快最有效的方法，可減輕顱內壓迫癥狀，為后續治療創造條件[2～4]。

研究表明血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)參與腫瘤的局部浸潤，是評估腫瘤患者病情及預后的重要指標，在人腦膠質瘤中異常表達，且表達強度與腦膠質瘤惡性程度呈正相關[5，6]。重組人骨形態發生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein，BMP)除促進骨和軟骨生成，在腫瘤的發生、增殖、侵襲過程也發揮重要作用，且與腦惡性腫瘤關系密切[7]。VEGF、重組人骨形態發生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、重組人骨形態發生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic protein-2，BMP-7)蛋白在復發腦膠質瘤患者中表達如何，對臨床治療預后意義如何，成為臨床醫生關注的熱點。本研究通過分析比較72例腦膠質瘤患者原發和復發術后瘤組織VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白的表達情況與臨床病理資料之間的關系，為該疾病診斷、治療、預后、評估提供依據，現總結歸納報道如下。

資料與方法

1.一般資料：選擇筆者醫院神經外科2012年1月～2015年1月收治的72例復發腦膠質瘤患者行手術治療，首次手術及復發后再手術均在筆者醫院完成，有完整臨床病理資料。其中男性44例，女性28例；患者年齡28～69歲，平均年齡45.3±11.9歲；72例患者原發病灶術后按照WHO CNS 2016病理分級：Ⅰ級4例，Ⅱ級18例，Ⅲ級31例，Ⅳ級19例，復發后病灶Ⅰ級0例，Ⅱ級7例，Ⅲ級34例，Ⅳ級31例[8]。所有患者均為原位復發，病灶位于額葉12例，顳葉11例，枕葉8例，額頂葉9例，額顳葉7例，顳頂葉10例，四腦室7例，其他部位8例。按病理類型分為星形細胞瘤17例，少枝膠質細胞瘤15例，少枝星形細胞瘤18例，多形性膠質母細胞瘤22例，復發術后病理性質未發生改變。首次術后6個月內復發5例，1年內復發19例，2年內復發35例，3年內復發13例，最短復發時間4.2個月，最長復發時間31.5個月，平均15.3±4.7個月。

2.試劑與儀器:兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗人BMP-2多克隆抗體、兔抗人BMP-7多克隆抗體、Ⅰ抗試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；JEDR801D形態學圖像分析系統Version6.0購自捷達科技有限公司等。

3.免疫組化方法：按照試劑盒說明書，將所有患者瘤組織標本10%甲醛溶液常規固定、石蠟包埋、4μm切片；切片后二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化、檸檬酸鹽緩沖液抗原修復，再自然冷卻。3%H2O237℃ 孵育，5%正常山羊血清37℃封閉，加Ⅰ抗(50μl)，冰箱4℃過夜。次日復溫，加Ⅱ抗，滴加SABC液，DAB顯色5min，蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，再烤干。所有標本均在同一條件下采用免疫組化SABC方法進行染色，均設PBS液陰性和陽性對照。在各病理組織內隨機選取10個視野(×400倍)，染色以胞膜、胞質出現棕黃色或黃褐色沉淀物為陽性表達。

4.免疫組化染色結果判定標準：在光學顯微鏡下以細胞膜、細胞質染色呈棕黃色顆粒為VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白表達陽性判定標準，按照Kraj ewska法進行半定量分析：在高倍鏡(×400)下隨機抽取 10個視野進行陽性細胞計數，計數陽性細胞率并分級：0級：計數比率<5%；1級：比率5%～25%；2級：比率25%～50%；3級：比率50%～75%；4級：比率>75%[9]。染色強度評價標準：陰性：0級；1 級：弱陽性；2級：陽性；3級：強陽性。最后，以陽性細胞率分級×染色強度分級/2≥0.5 判斷為免疫組化陽性表達。

5.隨訪生存：所有患者自復發后再次手術病理確診時開始隨訪，由專人通過電話、微信、QQ等方式聯系，無失聯病例，隨訪截止日期2018年3月1日，隨訪時間最短者3個月，最長者37個月。

結 果

1.可能影響VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白陽性表達的相關因素：對臨床病理資料采用Spearman等級分析，結果顯示，VEGF蛋白表達與性別、年齡、病理類型等資料不具有相關性，與WHO病理分級(rVEGF=0.375，P<0.05)及原發、復發(rVEGF=0.319，P<0.05)情況相關。BMP-2、BMP-7蛋白表達與性別、年齡、病理類型、WHO病理分級不具有相關性，與原發、復發(rBMP-2=0.492，P<0.05；rBMP-7=0.381，P<0.05)情況有關，詳見表1。

表1 VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白陽性表達與臨床病理特征相關性

2.VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白在原發及復發腦膠質瘤中的表達及分析：免疫組化結果顯示，VEGF 蛋白陽性表達主要集中在膠質瘤細胞質中，在原發、復發腦膠質瘤表達分別為52.8%(38/72)、68.1%(49/72)。BMP-2、BMP-7蛋白主要位于細胞質，呈彌漫性分布的棕黃色顆粒，強弱不等，在原發腦膠質瘤表達分別為61.1%(44/72)、59.7%(43/72)，在復發腦膠質瘤表達分別為70.8%(51/72)、69.4%(50/72)，PBS陰性對照無黃色顆粒沉積，詳見表2和圖1。

表2 VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白在原發及復發腦膠質瘤中的表達[n(%)]

圖1 腦膠質瘤患者VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白免疫組化表達(SABC,×400)A.VEGF蛋白表達；B.BMP-2蛋白表達；C.BMP-7蛋白表達；D.PBS陰性對照

3.VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白表達與隨訪關系：通過對腦膠質瘤患者復發術后隨訪統計分析，VEGF蛋白49例陽性表達者無進展生存期(progression free survival，PFS)為6.5±2.1個月，總生存期(overall survival，OS)為11.6±3.9個月；23例陰性表達PFS為8.9±2.8個月，OS為14.1±4.5個月。BMP-2蛋白51例陽性表達者PFS為5.9±1.9個月，OS為10.8±3.7個月；21例陰性表達PFS為8.2±2.6個月，OS為14.0±4.6個月。BMP-7蛋白50例陽性表達者PFS為5.2±1.6個月，OS為10.1±3.5個月；22例陰性表達PFS為7.9±2.2個月，OS為13.5±4.2個月。VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白陽性表達PFS及OS均短于陰性表達，差異有統計學意義(P<0.05)。

討 論

腦膠質瘤為顱內最常見原發惡性腫瘤，具有無控增殖，侵襲性生長，易復發等特點，本質上是一種多基因疾病，由于原癌基因過度表達，抑癌基因突變缺失，導致腫瘤細胞逃避正常生長調控機制，在此發病過程與多種細胞因子有關[10，11]。其中VEGF是一種具有分泌特點的外分泌蛋白，其家族成員有VEGF-A、PLGF、svVEGF，VEGF-A是通常所說的VEGF，作用最強，可以與特定的受體結合，激活多種信號通路，促進血管通透性增加，腫瘤新生血管形成，血管內皮細胞增殖，引起細胞遷移[12～14]。正常人體也會含有VEGF，可促進組織和器官發育，腫瘤組織中過度表達，過度表達的VEGF與其相應的受體特異性結合，誘發腫瘤血管生成，持續和廣泛的新生血管滿足了腫瘤細胞生長所需的營養成分，促進了腫瘤細胞的惡性增殖和侵襲性生長，加速腫瘤發展[15]。VEGF是促進血管生成的細胞因子，直接參與誘導腫瘤血管生成，已有多數研究證實VEGF表達程度與惡性程度密切相關[16，17]。

BMPs約有40多個家族成員，其中除了BMP-1為骨生長新的調節因子，屬于金屬鈦內切酶家族(the astacin family of metalloen-dopeptidases)之外，其余BMPs均屬于轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，BMPs家族成員有4個亞組，包括BMP-2、BMP-3、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-12、BMP-13、BMP-14等，其中BMP-2、BMP-7的研究較早也較為重要，近年來，大量研究表明，中樞神經系統腫瘤中可檢測到BMP-2和BMP-7的陽性表達，逐步認識到在腫瘤的發生、發展、增殖、侵襲和轉移中起重要作用[18]。

本研究通過免疫組化法檢測筆者醫院經手術確診的腦膠質瘤患者原發和復發標本，通過統計分析患者一般臨床病理資料，VEGF蛋白表達水平與性別、年齡、病理類型等臨床病理資料不具有相關性，與WHO病理分級(rVEGF=0.375)、原發或復發情況(rVEGF=0.319)具有相關性，而BMP-2、BMP-7蛋白表達水平與性別、年齡、病理類型、病理分級等臨床病理資料不具有相關性，與原發或復發(rBMP-2=0.492，rBMP-7=0.381)情況具有相關性，差異有統計學意義(P<0.05)。通過Spearman等級資料分析結果提示，WHO病理分級和原發復發情況是VEGF蛋白表達的影響因素，原發復發情況是BMP-2、BMP-7蛋白表達的影響因素。進一步研究分析，VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白表達水平在復發患者中表達水平明顯高于原發患者，提示可作為易復發患者的判定指標。通過隨訪分析，VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白陽性表達PFS及OS均短于陰性表達患者，差異有統計學意義(P<0.05)，因此還可作為高表達患者預后不良的判定指標。

綜上所述，VEGF、BMP-2、BMP-7在復發腦膠質瘤患者中高度表達，參與腦膠質瘤的生長浸潤過程，可以作為判定腦膠質瘤生物學行為的重要指標，還可作為腫瘤分子標志物，對于腦膠質瘤患者個體化治療及判斷患者預后提供指導意義。