濃香型白酒飲后不適感關鍵高級醇類物質關聯性判定新方法

格絨澤仁，皇甫潔，韓興林，江偉，王德良，劉書亮

1 (四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2 (中國食品發酵工業研究院，北京，100015)3(科技部國家酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京，100015)

飲酒不適感通常指人在飲酒后，呈現醉酒狀，出現頭暈、頭痛[1]。造成飲后不適感的原因相當復雜，除了飲酒人的身體狀況、飲用量、飲酒習慣、思維情緒及環境因素等以外[2]，還有酒體本身設計和質量的因素。目前研究結果表明，造成白酒飲后產生不適感原因，一是由于乙醇自身的麻醉作用和其所代謝產生的乙醛引起的腦缺氧[3]，二是由于酒體自身的復雜成分在人體內的作用以及代謝，這些物質包括高級醇，生物胺等物質[4-5]。其中高級醇是3個C以上一元醇類物質的總稱[6]，在白酒中常見的有異戊醇、正丙醇、異丁醇、正己醇等[7]。高級醇是濃香型白酒中的重要成分和呈味物質。適量的高級醇能夠使酒體醇甜，還能與酸酯化生成酯類物質，使酒體豐滿[8]。但由于高級醇化學結構較乙醇更為復雜，代謝也更加緩慢，過量累積會導致肝損傷[9-10]，同時其對人體神經系統所產生的毒害和麻醉作用比乙醇更強，其能使神經系統充血，對腦神經細胞的損害作用，使人產生頭疼、頭暈的感覺，引起大醉現象[11-14]。

曠場實驗(open field test, OFT)作為一個經典的動物行為學實驗，可以檢測小鼠的自發活動行為(locomotor activity)和探索行為(exploratory behavior)[15]。由于小鼠有畏懼空曠場地的天性，其活動具有趨避性(thigmotaxis)，而另一方面，又會對新環境產生好奇心進而進行探索[16]。常用的曠場系統是一個方形的箱子(亦有圓形)，小鼠在曠場中可以自由活動，箱子頂部有攝像機以記錄小鼠活動[17]。曠場實驗可通過1次實驗對小鼠的自發活動、探索行為及焦慮/抑郁狀態進行定量評價[18]。現階段，曠場實驗常應用于藥物副作用的檢測，如藥物對行動、睡眠的影響等[19]，是一個簡單實用的動物實驗手段。

因此，本研究通過小鼠的濃香型白酒灌胃模型，利用曠場實驗飲后行為分析結合白酒常規風味物質分析，建立對濃香型白酒中引起飲后不適感的關鍵高級醇的判定方法，確定在濃香型白酒中引起飲后不適的主要高級醇類物質。以進一步提高酒類品質，降低飲后不適感奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗酒樣和動物

酒樣：酒樣A、B、C、D、E、F分別為市售的6款不同品牌濃香型白酒，均為52%vol。

實驗動物：C57小鼠，雄性，清潔Ⅱ級，4～6周齡，由北京維通利華公司實驗動物有限公司提供。隨機選取小鼠80只，平均體重為(23±2) g，于室溫(23±2) ℃，光照(150 xl)12 h和黑暗12 h環境，自由飲水進食飼喂，1周后進行實驗。實驗前提前1 d將小鼠置于曠場實驗室以適應環境；實驗時，將小鼠隨機分為實驗組(酒樣A、B、C、D、E、F組)、對照組1(Control 1，52%vol食用酒精)和對照組2(Control 2，生理鹽水)，每組10只。

1.2 儀器與設備

Clarus 590/690氣相色譜火焰離子化檢測器(gas chromatography-flame ionization detection,GC-FID)，美國PerkinElmer公司。

曠場實驗動物行為學跟蹤系統ANY-Maze系統(v.4.72)，美國Stoelting公司。該儀器主要由一個半徑為20cm的白底箱壁透明半封閉有機玻璃圓筒組成，其頂部中央懸掛有攝像機，并與記錄系統相連，以此來跟蹤小鼠在曠場中的行為，其數據由ANY-Maze軟件進行記錄并分析。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠灌胃

按照實驗分組對實驗動物分別進行灌胃，實驗各組和對照組1灌胃劑量均為15 mL/kg，對照組2采用等量生理鹽水進行灌胃。

1.3.2 曠場實驗

在灌胃完成后，計錄時間。在30 min后，依次按照分組將每只小鼠放置于曠場底面中央。利用高頻攝像機及軟件跟蹤記錄動物在曠場內自由運動60 s內的行為變化。采集的數據包括活動總路程、移動平均速度、停滯時間及停滯次數[20]。實驗過程中保持安靜，動作輕柔；每只動物實驗結束后及時清除糞便，使用72%(體積分數)乙醇溶液清潔底面并擦干，減少之前動物的氣味，防止行為干擾。

1.3.3 醇類物質測定

色譜條件：自動進樣器；進樣口溫度：240 ℃；載氣：N2；流速：1 mL/min；FID檢測器溫度：FID(280 ℃)；H2：45 mL/min；空氣：450 mL/min；色譜柱：CP-Wax57CB (50 m×0.25 mm×0.20 μm)。升溫程序，起始溫度：35 ℃，保持4.00 min；以4.0 ℃/min升溫到60 ℃，再以10.0 ℃/min升溫到130 ℃，再以15.0 ℃/min升溫到205 ℃，保持15.00 min。采用30∶1分流比進樣。采用內標法。內標濃度為：叔戊醇1%，乙酸正丁酯1%，2-乙基丁酸1%(體積分數)。

1.4 實驗數據統計分析

本實驗結果采用SPSS Statistics 24軟件，使用單因素ANOVA方法進行統計，并使用Tableau作圖，數據使用均數±標準誤表示；同時，利用SPSS Statistics 24.0軟件，使用其中的降維功能，分別使用數值變量對應分析方法和因子分析方法對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 曠場實驗結果

本研究前期研究成果表明，灌胃30 min～1 h小鼠血液乙醇積累程度達到最高，對行為影響最大。所以本實驗對灌胃后30 min小鼠行為數據進行統計，結果(表1，圖1)發現，對照組1小鼠在曠場中的活動總路程為(6.607±0.723) m，平均速度為(0.110±0.030) m/s，相較于對照組2的(7.479±0.085) m和(0.125±0.001) m/s略有所下降，但在統計學上均無顯著性差異(P>0.05)；而兩者在曠場中的停滯時間分別為(1.850±0.238) s和(1.660±0.245) s，食用酒精組時間略長于生理鹽水組，但差異不顯著(P>0.05)；在停滯頻數上，食用酒精組和生理鹽水組并無顯著差異(P>0.05)。本研究旨在判定濃香型白酒中可能引起飲后不適的關鍵高級醇類物質，需消除乙醇的干擾，所以在其后的實驗中選擇食用酒精組與實驗組進行比較。

表1 各組小鼠曠場中運動的行為學指標Table 1 Behaviors of different groups’ mice in open field

而在各實驗組與食用酒精組的比較中發現，酒樣B、D、E、F組灌胃30 min后的小鼠，在曠場運動1 min內，活動總路程和平均速度均顯著增加(P<0.05)；灌胃A、E兩組酒樣的小鼠停滯時間和停滯次數均顯著低于食用酒精組(P<0.05)，而C組小鼠的停滯時間則顯著高于食用酒精組(P<0.01)，B、D、F組的停滯次數相較于食用酒精組明顯增加(P<0.05)。將A、B、C、D、E、F各行為學指標進行對應分析，對應分析圖結果見圖2，酒樣E灌胃后的小鼠活動總路程較長，同時停滯時間和停滯次數減少；酒樣F灌胃后的小鼠停滯次數更多，酒樣C灌胃后小鼠停滯時間變長；酒樣D灌胃后小鼠平均速度更快，同時小鼠的停滯次數也會相應增加。

A-活動總路程；B-平均速度；C-停滯時間；D-停滯次數圖1 各組小鼠灌胃30 min后在曠場中運動1 min的行為學指標Fig.1 Behavioral indices of mice in different group who who exercised in open field for 1 minute after 30 minutes of gavage注：*代表差異顯著，P<0.05。

結合圖1和圖2分析可知，在酒樣E的作用下，小鼠的運動能力提高，呈現出酒后興奮，同時其受抑制出現間斷性麻木的情況最輕，說明該酒樣所引起的小鼠興奮并非異常興奮；小鼠在酒樣A的作用下，受抑制出現間斷性麻木的情況較輕，但其運動能力提高并不明顯，說明其興奮受到抑制，呈現醉酒狀；酒樣F作用下的小鼠受抑制出現間斷性麻木的次數增加，酒樣C則造成小鼠間斷性麻木的時間最長，同時兩組小鼠運動能力都有所提高，說明在這兩種酒樣的作用下，小鼠的運動能力應屬于在異常狀態下產生的興奮，即飲后不適感所引起的刺激；同理，酒樣D雖然引起小鼠運動能力提高在所有酒樣中程度最高，但其對小鼠所造成的間斷性麻木時間和次數也處在較高水平，由此可認為酒樣D造成飲后不適所引起的興奮程度最強。

圖2 酒樣-行為指標對應分析圖Fig.2 The correspondent analysis chart between Baijiu samples and mice’s behaviors

綜上所述，可以發現，酒樣D為引起小鼠飲后不適感最強的酒樣，而酒樣E為引起小鼠飲后不適感程度最弱的酒樣。

2.2 六款濃香型白酒醇類物質成分的定量檢測結果

將A、B、C、D、E、F六款白酒按照給定條件進行GC-FID檢測，檢測共計13種醇類物質，其中包含12種高級醇，分別為仲丁醇、正丙醇、異丁醇、2-戊醇、正丁醇、活性戊醇、異戊醇、正戊醇、正己醇，1，2-丙二醇、糠醇以及2-苯乙醇，各酒樣醇類物質含量測定結果見表2。

表2 六款酒樣醇類物質含量 單位：mg/L

2.3 PCA主成分分析結果

通過PCA將所檢測出的除乙醇外的其他醇類物質(共計13種)作為指標進行分析，共計得到13個主成分，其中主要的主成分各自的特征值、貢獻率(方差百分比)及累積貢獻率(累積)見表3，因子負荷矩陣見表4。

表3 主成分提取總方差解釋Table 3 Total variance explained by PCA

表4 因子負荷矩陣分析Table 4 Component matrixan alysis

由表3可知，前3個主成分特征根大于1，且累計貢獻率達到92%，故選擇前3個因子。從表4中可以得知，異戊醇、異丁醇和2-戊醇在主成分1(FAC 1)上有較大載荷；正戊醇，正己醇及正丁醇在主成分2(FAC 2)上有較大載荷；仲丁醇、正丙醇則在主成分3(FAC 3)中擁有較大載荷。將上述PCA所得結果進行投影后，3個因素間可得PCA投影圖,如圖3所示。

圖3 醇類物質PCA投影圖Fig.3 Projection plot of principal component analysis for alcohols

由圖3可以發現，各酒樣中3個主成分的權重各不相同，較為直觀地表明不同酒樣中不同主成分所代表的物質貢獻不同。由圖3可知，酒樣A中FAC 3所占權重最大，說明FAC 3所代表的正丙醇和仲丁醇在其所含醇類物質中起到主要作用；酒樣B中則為FAC 1所代表的異戊醇、異丁醇和2-戊醇在其所含醇類物質中起到主要作用；酒樣C受3個主成分影響，但其中以FAC 2所代表的正戊醇，正己醇及正丁醇起主要作用；酒樣D中，FAC 1所代表的異戊醇、異丁醇和2-戊醇起到了主要作用，其程度較之于酒樣B更為突出；酒樣E中則3個主成分均不起主要作用；酒樣F中是以FAC 2所代表的正戊醇，正己醇及正丁醇起主要作用。

3 結論

曠場實驗作為評價嚙齒類動物運動功能和焦慮行為的經典方法，被廣泛運用于藥理學的基礎研究中[21]。動物對新奇環境的探究習性和對空曠場地恐懼的矛盾沖突是曠場實驗的主要原理，動物水平運動情況代表其運動活性[22]。本研究基于小鼠行為學實驗和酒樣常規風味物質測定，通過將兩者結合分析對能引起濃香型白酒飲后不適的關鍵物質進行初步判定。行為學實驗結果表明，酒樣D能引起小鼠較為強烈的飲后不適感，而酒樣E為引起小鼠飲后不適感程度最弱的酒樣；從酒樣中風味物質分析結果來看，酒樣D中起主要作用的高級醇是異戊醇、異丁醇和2-戊醇，且觀察異戊醇含量發現，酒樣D在所有酒樣中為最高，而引起小鼠飲后不適感程度最弱的酒樣E中異戊醇含量在所有酒樣中最低。將上述行為實驗結果與物質含量測定結果相對應，可初步判定異戊醇為引起濃香型白酒飲后不適的關鍵高級醇之一，推測其含量愈高的濃香型白酒，飲后不適感愈強。

同時，通過實驗發現，酒樣A作用的小鼠雖受抑制出現間斷性麻木的情況較輕，但其運動能力提高并不明顯，說明其興奮受到抑制，呈現出醉酒狀；而在酒樣風味物質的分析中，發現酒樣A起主要作用的高級醇為正丙醇和仲丁醇，正丙醇含量為所有酒樣中最高的，所以將其行為實驗結果與物質含量測定結果相對應，懷疑濃香型白酒中正丙醇含量越高，其越易造成飲后易醉的現象。但濃香型白酒作為一個復雜的體系，要進一步確定異戊醇和正丙醇是否是引起濃香型白酒飲后不適的關鍵高級醇，以及本研究所使用方法可否應用于其他香型白酒，還需更加深入的研究。本文旨在以進一步提高酒類品質，為降低飲后不適感奠定基礎。