兩種抗菌劑對不同溫度下形成的單增李斯特菌生物膜的清除作用

何美珊，丁楠，盧承蓉，上官文丹，鐘青萍*

1(廣東省食品質量與安全重點實驗室，華南農業大學 食品學院，廣東 廣州，510642)2(華農(潮州)食品研究院有限公司，廣東 潮州，521000) 3(廣東展翠食品股份有限公司，廣東 潮州，521000)

細菌生物膜(biofilm，BF)是細菌群體由自身分泌的胞外多聚物包裹，并緊緊黏附于物體上的一種生存模式。生物膜內復雜結構，代謝廢物的沉積、中心區域缺氧、有限的營養物質和酸性環境等因素促進生物膜中“活的非可培養”(viable but non-culturable state，VBNC)細菌的形成，導致與浮游細胞相比，生物膜內的細菌更難以被抗生素清除[1-2]。單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)為革蘭氏陽性菌，是一種重要的食源性致病菌，能引起人類和動物嚴重的疾病，致死率較高(16%～38%)[3]。目前李斯特菌導致的疾病呈逐年上升的趨勢，在德國，2016年李斯特菌致死率達7%，是幾種常見腸道致病菌中引起死亡人數最高的細菌[4]。2018年南非爆發李斯特菌感染疫情，共915例感染，180人死亡。在國內，根據歷年李斯特菌病的統計，1999年～2014年李斯特菌病的病例數呈明顯上升趨勢，特別是新生兒感染者或中樞神經系統感染者病情嚴重，死亡率較高[5]。李斯特菌可在低溫下生長，而且其形成的生物膜難以從食品加工設施中根除[6]。但目前對生物膜的研究主要集中于常溫下形成的生物膜，對低溫下生物膜中致病菌的生存機制的研究還比較欠缺。

目前國內外控制生物膜的方法主要有采用抗生素、酸性和堿性消毒劑、氧化劑、植物精油、中草藥、超聲波、等離子體和酸性電解水等進行處理[7-14]。但因價格等方面問題，在食品加工中，大多仍使用乳酸、次氯酸鈉、過氧化氫等消毒劑進行殺菌處理，但并不能完全清除生物膜。而作為常規抗生素替代品的植物精油是目前研究的一個熱點，是食品防腐保鮮的新型天然抗菌劑。目前發現薰衣草精油對多種真菌和細菌都有抑制作用，其可作用于細菌的不同部位，如細胞膜、細胞壁或細胞內的蛋白質和核酸[15-16]。84消 毒液是食品行業最常用的消毒劑之一。但目前有關薰衣草精油和84消毒液對單增李斯特菌生物膜清除效果的研究較少，因此本研究首先考察單增李斯特菌在32 ℃和10 ℃下生物膜的形成情況，在此基礎上進一步分析不同濃度的薰衣草精油和84消毒液對其形成的生物膜的清除效果，并探究低溫環境對單增李斯特菌生物膜抗性的影響，對控制單增李斯特菌，消除其殘留，保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單增李斯特菌ATCC19115，購于廣東微生物菌種保藏中心；腦心浸液肉湯(brainheart infusion broth, BHI)，廣東環凱微生物科技有限公司；薰衣草精油(純度99%)，青島優索化學科技有限公司；84消毒液，藍月亮(中國)有限公司；2×SGExcel FastSYBR mixture(plus)、細菌基因組DNA提取試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；疊氮溴化丙錠(propidium monoazade，PMA)，美國Biotium公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan FC酶標儀，Thermo公司；650W鹵鎢燈，德國Osram公司；CFX96 Touch熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

單增李斯特菌接種于BHI培養液中，37 ℃、150 r/min 培養12 h后，4 ℃ 4 000 r/min離心15 min收集菌體，以無菌生理鹽水調整菌液濃度為107CFU/mL待用。

1.3.2 生物膜的形成及其測定

1.3.2.1 生物膜的培養和生物量的測定

生物膜的培養和定量檢測參考BRENDA等的方法[17]，具體步驟如下：在無菌12孔板中垂直放置無菌玻璃片(20 mm×20 mm)，將菌懸液與BHI按1∶4體積比混勻后再按5 mL/孔加入到12孔板中，菌初始濃度為107CFU/mL。將孔板在32 ℃及10 ℃分別孵育1 d及30 d，定期測定生物膜的形成量。

采用結晶紫染色法(crystal violet staining,CV法)測定生物膜的形成量，將附著生物膜的玻璃片用10 mL 無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffersalino,PBS)洗滌3次去除浮游細胞。65 ℃干燥固定30 min，并在室溫下用5 mL 0.1%結晶紫染色30 min。用無菌蒸餾水清洗3次。干燥后，溶解于5 mL 33%乙酸中，以酶標儀測定595 nm處的吸光度。

1.3.2.2 生物膜的代謝活性測定

采用XTT法，將形成生物膜的玻璃片轉移至含有5顆玻璃珠和10 mL PBS的無菌離心管中，使用渦旋劇烈振蕩2 min，將生物膜細胞收集在無菌的10 mL離心管中。在96孔板中每孔中加入100 μL生物膜懸液，然后將XTT溶液和甲萘醌溶液按12.5∶1(體積比)混合后，每孔加入50 μL，37 ℃避光孵育4 h，在450 nm下測定吸光值。

1.3.3 PMA-qPCR測定活菌數

1.3.3.1 PMA處理菌體及DNA模板的制備

取0.5 mL菌液于1.5 mL離心管中，加入終濃度為40 μmol/L的PMA，充分混勻，黑暗孵育5 min，然后置于冰上，距離650 W鹵鎢燈20 cm曝光5 min，離心(8 000 r/min，2 min)收集菌體，加入40 g/L溶菌酶37 ℃處理1 h，用試劑盒提取模板DNA，-20 ℃保存備用。

1.3.3.2 引物設計與合成

根據GenBank中的單增李斯特菌的hly基因，在保守區域用Primer 5.0設計PCR引物，上游引物序列(5’→3’)GGTGGCTCCGCAAAAGATGAAG,下游引物序列(5’→3’)AGGCAATGGGAACTCCTGGTGT，由上海生工有限公司合成。

1.3.3.3 熒光定量PCR反應

反應體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL， 上下游引物各0.5 μL(終濃度20 μmol/L)，DNA模版5 μL，補水至25 μL。反應程序：95 ℃、3 min； 95 ℃、10 s，56 ℃、40 s；72 ℃、40 s；39個循環。循環結束后72 ℃保持5 min。熔解曲線：65～95 ℃， 升溫速率為0.5 ℃/s。

1.3.4 可培養菌數的測定

采用稀釋平板法測定可培養菌數。吸取100 μL經過稀釋的菌液，均勻涂布于營養瓊脂平板上，于37 ℃ 培養24～48 h后進行菌落計數，每個稀釋濃度均設置3個平行。

1.3.5 不同制劑對不同溫度下形成的單增李斯特菌生物膜的作用

1.3.5.1 最低抑菌濃度(MIC)的測定

用96孔板微量稀釋法測定84消毒液、薰衣草精油的最小抑菌濃度。將84消毒液、薰衣草精油以MH肉湯培養基2倍稀釋成8個梯度。每個孔中加入100 μL MH肉湯培養基，第一個孔中加入100 μL制劑混勻，然后吸取100 μL至第2孔，混勻后再吸取100 μL到第3個孔，以此類推到第8孔，從第8孔吸取100 μL棄去，再在每個孔中加入100 μL菌液，使菌液的終濃度是107CFU/mL。每個實驗做3次重復，同時設置陰性對照和陽性對照。在32 ℃培養24 h， 用酶標儀在595 nm處測定OD值。

1.3.5.2 測定2種制劑對成熟生物膜的清除作用

12孔板中菌液的初始濃度為107CFU/mL,將玻璃片置于其中，分別在32 ℃及10 ℃孵育12 h及19 d， 使其成熟生物膜得到相同活菌數，把成熟生物膜取出用PBS清洗2次，棄去浮游菌，放入無菌培養皿中，分別加入不同濃度(1/2、1、2、4 MIC)的制劑5 mL， 分別在10和32 ℃處理0.5、1、2、3、6 h，按照上述方法測定生物膜生物量和代謝活性的變化，以及活菌數和可培養數，并計算清除率，如公式(1)所示。

(1)

1.4 統計分析

應用SPSS 13.0 軟件進行方差分析，并以最小顯著差(least significant difference，LSD)進行組間比較。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下單增李斯特菌生物膜的形成

由圖1-A所示，單增李斯特菌在32 ℃下培養16 h后，形成的生物膜總量最多，代謝最旺盛，隨著培養時間延長，生物膜總量和代謝活性也隨之減少，結果表明，單增李斯特菌生物膜在32 ℃、16 h后達到成熟。圖1-B表明，單增李斯特菌在10 ℃下第19天時生物量以及代謝活性最大。取單增李斯特菌在32 ℃、12 h和10 ℃、19 d下的生物膜計算活菌數，結果分別為(8.81±0.42)lg CFU/cm2、(9.09±0.05)lg CFU/cm2，通過T檢驗沒有顯著差異。

2.2 薰衣草精油對不同溫度下形成的單增李斯特菌生物膜的清除作用

經測定薰衣草精油對單增李斯特菌的MIC值為1.6%(體積分數)。采用1/2、1、2、4 MIC的薰衣草精油處理10 ℃和32 ℃形成的生物膜，結果表明，隨著薰衣草濃度和處理時間的增加，對生物膜的清除作用逐漸增強，4 MIC的薰衣草精油處理3 h時對32 ℃生物膜的生物量清除率和代謝活性的減少率分別為82%和73%，對低溫生物膜的清除作用為56%和50%(圖2)。

A-32 ℃；B-10 ℃圖1 不同溫度下單增李斯特菌的生物膜的形成Fig.1 Biofilm formation of L. monocytogenes at different temperatures

A-32 ℃生物膜的生物量清除率；B-32 ℃生物膜的代謝活性減少率；C-10 ℃生物膜的生物量清除率；D-10 ℃生物膜的代謝活性減少率圖2 薰衣草精油對32 ℃和10 ℃下形成的單增李斯特菌生物膜的作用Fig.2 Effects of lavender essential oil on L. monocytogenes biofilm formed at 32 ℃ and 10 ℃

2.3 84消毒液對不同溫度下形成的單增李斯特菌生物膜的清除作用

經測定84消毒液對單增李斯特菌的MIC值為2.5%(體積分數)。采用1/2、1、2、4 MIC的84消毒液處理10 ℃和32 ℃形成的生物膜，結果顯示，隨著84消毒液濃度的升高和處理時間的延長，清除率逐漸增加，4 MIC處理32 ℃生物膜3 h時，生物量和代謝清除率為78%和60%，對10 ℃生物膜的清除率為56%和48%。低溫生物膜的抗性更強。兩種制劑對常溫生物膜的清除能力均比低溫生物膜效果顯著(圖3)。

A-32 ℃生物膜的生物量清除率；B-32 ℃生物膜的代謝活性減少率；C-10 ℃生物膜的生物量清除率；D-10 ℃生物膜的代謝活性減少率圖3 84消毒液對32 ℃和10 ℃下形成的單增李斯特菌生物膜的作用Fig.3 Effects of 84 disinfectant on L. monocytogenes biofilm formed at 32 ℃ and 10 ℃

2.4 不同制劑處理對不同溫度下形成的生物膜細胞的影響

采用4種濃度的薰衣草精油和84消毒液處理兩種溫度下形成的單增李斯特生物膜3 h，活菌數和可培養數如圖4所示。

經過薰衣草精油處理后，32 ℃生物膜較10 ℃生物膜的菌數下降明顯，4 MIC處理下，32 ℃生物膜活菌數減少6.35 lg CFU/cm2，可培養數減少9.01 lg CFU/cm2。低溫生物膜處理前活菌數為9.09 lg CFU/cm2，可培養菌數為5.78 lg CFU/cm2，約有3.32 lg CFU/cm2細胞進入VBNC狀態；經4 MIC薰衣草精油處理后活菌數為5.94 lg CFU/cm2，減少了3.16 lg CFU/cm2，可培養數為3.85 lg CFU/cm2，減少了1.93 lg CFU/cm2，仍存有VBNC細胞。4 MIC濃度處理下，10 ℃生物膜中殘留更多的活菌和VBNC細胞(圖4-A)。圖4-B顯示，4 MIC的84消毒液處理后，32 ℃生物膜中生物膜活菌減少量為3.68 lg CFU/cm2，而10 ℃生物膜減少量約2.88 lg CFU/cm2。薰衣草精油比84消毒液對生物膜中活菌數的減少更加顯著。

A-薰衣草精油；B-84消毒液圖4 兩種制劑對兩種溫度下形成的單增李斯特菌生物膜細胞的影響Fig.4 Effects of two agents on L. monocytogenes cells in biofilms formed at two temperatures

3 討論

本研究考察了32 ℃和10 ℃下單核細胞增生李斯特菌的生物膜的形成，并分析了2種制劑對其成熟生物膜的清除作用。選擇32 ℃主要為該菌的適宜生長溫度且為夏季常見溫度。另外，果蔬及肉制品通常儲存于0～4 ℃，但實際上，在冷藏條件和運輸過程中，溫度可能升高至10 ℃[18]。基于單增李斯特菌能耐低溫，因此本研究亦考察10 ℃低溫對其生物膜形成及其抗性的影響。

DI BONAVENTURA等[19]發現與聚苯乙烯、不銹鋼相比，在玻璃表面上單增李斯特菌在4、12和22 ℃更易形成生物膜，而在37 ℃時，在不銹鋼和玻璃表面上能形成相當量的生物膜。玻璃為食品加工及儲藏中常見的接觸面，因此本研究在玻璃面上考察不同溫度下單增李斯特菌生物膜的形成特性，研究結果表明，單增李斯特菌在低溫下能形成穩定的生物膜，但生物膜量顯著低于32 ℃，在32 ℃時單增李斯特菌能更快形成生物膜。這可能是由于溫度升高細胞生長加快，而且細胞疏水性隨溫度升高而增加，從而增強了細胞黏附能力[20]。此外，鞭毛是細胞運動所必須的，與生物膜形成密切相關，VATANYOOPAISARN等[21]發現單核增生李斯特菌的運動性在較低溫度下急劇下降，可能導致細胞附著量較低，形成的生物膜較少。然而隨著培養時間延長，單增李斯特菌在10 ℃下培養19 d時生物膜活菌數為(9.09±0.05)lg CFU/cm2，表明其在低溫下能長期存活并形成生物膜。

本研究以不同濃度的薰衣草精油和84消毒液處理單增李斯特菌在32 ℃和10 ℃下形成的成熟生物膜，采用結晶紫法和XTT法分析其對生物膜清除的效果。結果表明，隨著濃度和處理時間的增加，薰衣草精油和84消毒液對生物膜的代謝活性和生物量清除效果逐漸增強，但對32 ℃生物膜的效果優于對10 ℃下形成的生物膜(圖2和圖3)。低溫下形成的生物膜對防腐消毒劑的耐受性的機制有待于進一步研究。

為分析其抗性，本研究首先測得32 ℃孵育12 h與10 ℃孵育19 d的生物膜具有相當的活菌數，以此為材料進一步定量評估薰衣草精油和84消毒液對兩種溫度下形成的生物膜中細菌的殺滅能力，分別測定處理3 h后的可培養菌數和活菌數。總的來說，10 ℃生物膜對兩種制劑的敏感性比32 ℃下形成的生物膜更低。PUGA等[22]以殼聚糖處理20 ℃和4 ℃形成的單增李斯特菌生物膜，發現4 ℃形成的生物膜更薄但對殼聚糖的抗性更強，可能是在低溫形成的膜基質致密性增加從而影響殼聚糖滲透。細菌VBNC狀態是指其不能在傳統培養基上生長繁殖，但仍具有活性，并可在適宜條件下復蘇的特殊狀態[23]，與正常細胞相比，VBNC細胞表現出比可培養的細胞更低的代謝活性，能繼續保持膜完整性。我們發現，在低溫形成的生物膜中，約有1/3的單增李斯特菌細胞進入VBNC狀態，這可能與低溫生物膜對防腐消毒劑的抗性增強密切相關。NOWAKOWSKA等[24]發現低溫誘導的VBNC創傷弧菌具有更強的對熱、氧化應激、滲透壓、pH、乙醇、重金屬和抗生素的耐受性。

薰衣草精油主要成分為乙酸芳樟酯和芳樟醇，CHERRAT等[25]以5種精油分別處理單增李斯特菌和大腸桿菌280 min或24 h后，使用熒光探針監測細菌的膜流動性和完整性，發現香薄荷精油和月桂精油能使細胞膜表面硬化，可滲透在細胞質膜中與膜中存在的蛋白質相互作用并擾亂它們的功能。DI PASQUA等[26]研究發現一些細菌可以改變膜脂肪酸組成，以抵消精油活性成分對細胞膜流動性的影響，從而維持細胞膜的結構和功能。

84消毒液的主要成分為次氯酸鈉，次氯酸鈉是食品工業中常用的消毒劑,在水中形成次氯酸，其主要作用機理為次氯酸能與質粒DNA直接反應導致雙鏈斷裂，以及侵入細胞內部與蛋白質發生氧化作用[27-28]。徐冬旸等[29]研究表明，常規濃度的84消毒液處理可抑制李斯特菌的生長，而LEE等[30]研究發現游離氯只能使外部生物膜失活，而內部生物膜不受游離氯的影響，游離氯不能完全滲透生物膜。NORWOOD[31]以1 000 mg/L的次氯酸鈉處理單增李斯特菌生物膜20 min， 結果可培養細胞減少2 lg CFU/mL，而去除相同量的浮游細胞僅需要10 mg/L的次氯酸鈉。VBNC細胞的低呼吸活動意味著與細胞外環境的營養和能量交換減少，使其在饑餓壞境及氯和氯胺消毒中存活[32]。本研究發現84消毒液和薰衣草精油處理0.5～1 h對32 ℃生物膜與10 ℃生物膜的清除效果差異不大，隨著時間延長，對32 ℃生物膜的清除作用高于10 ℃生物膜。薰衣草精油對32 ℃生物膜活菌的清除能力高于84消毒液，而2種制劑對10 ℃生物膜活菌的清除效果相差不大。2種制劑均能誘導部分生物膜細胞進入VBNC狀態，使平板計數結果遠低于活菌數。低溫生物膜可增強單增李斯特菌對防腐消毒劑的抗性，需增加劑量或延長處理時間才能有效清除生物膜細胞。