大麥β-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中異源表達

汪薛良，鈕成拓，包敏，李崎，王金晶*

1(江南大學，釀酒科學與工程研究室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

β-淀粉酶，又稱麥芽糖苷酶[1]，是一種外切型糖化酶。它能從淀粉的非還原性末端開始依次切開間隔的α-1,4糖苷鍵生成麥芽糖和β-極限糊精[2]。β-淀粉酶被廣泛應用于食品糧食加工、發酵工業、醫藥等行業[3]，是一種需求量巨大的重要工業用酶，在啤酒釀造，β-淀粉酶作為糖化劑也有著不可替代的作用[4]。

β-淀粉酶主要來源于一些高等植物及少數微生物，如大麥、甘薯、水稻、芽孢桿菌等。植物來源的β-淀粉酶的酶活力普遍較高，溫度穩定性較好，作用pH范圍較廣[5]，相比于植物來源的β-淀粉酶，微生物來源的β-淀粉酶最適溫度和熱穩定性普遍較低[6]。目前，工業所使用的β-淀粉酶主要來自于植物提取與微生物發酵，其中大麥提取的β-淀粉酶由于其應用效果好而深受工廠的青睞，但是大麥中的β-淀粉酶含量不高，提取工藝復雜導致其提取成本較高，且耗費大量糧食[7]。微生物發酵產酶雖然產量高，但是通常由于其穩定性不夠而難以達到好的使用效果，因此研究者們開始關注于微生物異源表達植物來源的β-淀粉酶。張蕭蕭等構建并篩選得到了1株高分泌表達大麥β-淀粉酶的重組巴斯德畢赤酵母GS-BBA，重組酵母在搖瓶發酵條件下的酶活為180 U/mL[8]；許黎明等還將大豆β-淀粉酶在畢赤酵母中實現了高密度發酵表達，經過混合碳源誘導后的酶活達到了310 U/mL[9]。但是由于畢赤酵母的誘導表達往往需要添加甲醇，難以直接應用于工業生產。另外還有大量研究者將大麥β-淀粉酶導入大腸桿菌實現了重組表達，但是發現異源表達出的β-淀粉酶的熱穩定性較差，容易被降解而失去活力[10-11]。

由于目前階段大麥β-淀粉酶的微生物重組表達均存在一定的缺陷，需要找到一個合適的宿主來進行大麥β-淀粉酶的重組表達?？莶菅挎邨U菌是非致病性的革蘭氏陽性菌，不含內毒素，且發酵條件簡單，細胞生長密度高，分泌蛋白能力強，是一類重要的工業酶制劑生產菌種。全球大約有50%的工業酶制劑是由枯草芽孢桿菌生產[12]，是美國食品藥品監督管理局授予GRAS(公認安全)的微生物，被歸入食品級微生物范疇[13]。因此開發利用枯草芽孢桿菌表達系統生產食品添加劑將成為主要趨勢。WB800為敲除了8個蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌菌株，可更加高效地表達重組蛋白且便于后續的蛋白質提純。因此，本研究選用枯草芽孢桿菌WB800作為宿主來異源表達大麥來源的β-淀粉酶，探索其分泌表達大麥β-淀粉酶基因的可行性并對重組表達的β-淀粉酶酶學性質進行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株質粒與試劑

大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌WB800，均為本研究室前期保藏；大麥β-淀粉酶基因的載體pET-28a(+)-amyB,為本研究室前期所構建[10]；pP43NMK，為張曉舟博士所構建的枯草芽孢桿菌分泌表達質粒載體[14]，于本研究室保藏。載體限制性內切酶、大腸桿菌感受態細胞制備試劑盒，購自大連TaKaRa生物工程有限公司；無縫克隆試劑盒SoSoo，購自北京擎科新業生物技術有限公司；質粒小提試劑盒、Cycle Pure PCR產物回收試劑盒等，購自OMEGA Bio-tek公司；β-淀粉酶試劑盒、BETAMYL-3，購自愛爾蘭Megazyme公司；商品β-淀粉酶，購自北京生東科技公司；其他試劑均為國藥集團有限公司產品。

1.1.2 培養基配制

LB培養基(g/L)：酵母膏5、蛋白胨10、NaCl 10。

Superrich培養基(g/L)：葡萄糖30、酵母膏20、蛋白胨25、K2HPO43。

SP-A鹽溶液(g/L)：(NH4)2SO44、K2HPO4·3H2O 28、 KH2PO412、二水合檸檬酸三鈉2。

SP-B鹽溶液(g/L)：MgSO4·7H2O 0.4。

100×CAYE溶液(g/L)：酪蛋白水解物20、酵母膏100。

SPI培養基(20 mL)：9.8 mL SP-A鹽溶液、9.8 mL SP-B鹽溶液、200 μL葡萄糖溶液、200 μL 100×CAYE溶液。

SPⅡ培養基(6 mL)：5.8 mL SPI培養基、60 μL 50 mmol/L CaCl2溶液、60 μL 250 mmol/L MgCl2溶液、80 μL雙蒸水。

1.2 實驗方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌表達載體的構建

本研究中表達載體的構建采用的是無縫克隆的方法，相比于傳統的雙酶切連接法更加高效。以pET-28a(+)-amyB為模板，根據pP43NMK中插入的基因兩端酶切位點設計引物如下：

P1(F): AACACATGCCTCAGCATGGAAGTTAATGTGAAGGGCAAC；

P2(R): TGATTACGCCAAGCTTTACATTGTCGCAGGCAGTTCG。

PCR反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性1 min； 56 ℃退火45 s；72 ℃延伸2 min；72 ℃再延伸5 min，循環30次。同時采用Hind Ⅲ、PstI限制性內切酶將pP43NMK線性化后，切膠回收純化后按照說明書上的反應體系進行連接反應并轉化大腸桿菌[15]。雙酶切驗證正確后采用EGTA螯合的方法將得到的重組質粒pP43NMK-amyB轉化枯草芽孢桿菌[16]。

1.2.2 重組酶的表達與純化

將重組枯草芽孢桿菌接種至50 mL含Kan的Superrich液體培養基中，于37 ℃、180 r/min振蕩培養。定時取培養液測定OD600與酶活力值，在酶活力值得到峰值時收集菌液，于4 ℃、6 000 r/min離心20 min收集上清液。向上清液中緩慢加入粉末狀(NH4)2SO4至不同終點飽和度(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)，4 ℃靜置過夜。次日將得到的溶液分別離心后測定上清液的酶活力值，確定二次鹽析最適飽和度后，取發酵上清液加入低飽和度的(NH4)2SO4去除雜蛋白，再加入高飽和度(NH4)2SO4沉淀蛋白。用20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液溶解沉淀后放入截留分子質量為3 500 kDa的透析袋中并置于去離子水中透析過夜，期間數次更換去離子水。得到的溶液采用Hi Trap QHP陰離子交換柱純化，柱體積為5 mL， 上樣量為30 mL，流速為2 mL/min，先后采用含0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫。收集洗脫峰并測定酶活，采用截留分子質量為10 kDa的蛋白超濾濃縮離心管對洗脫液進行濃縮，經SDS-PAGE鑒定后將得到的溶液置于4 ℃保存。

1.2.3 重組酶的酶活力測定

β-淀粉酶酶活力的測定采用DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)法，首先取6支25 mL具塞比色管，分別加入0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL麥芽糖標準溶液(1 g/L)，然后向各管中加入蒸餾水至2 mL，再加入3 mL DNS試劑，沸水浴加熱10 min，取出冷卻至室溫，取2 mL反應液加蒸餾水稀釋至10 mL?；靹蚝笠晕醇欲溠刻菢藴嗜芤旱谋壬転閷φ赵?540 nm 下測量吸光度，繪制標準曲線，得出其線性回歸方程為y=2 979+0.022 6(R2=0.993 5)。進行樣品測定時分別加入1 mL酶液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋)與1 mL 1%淀粉溶液，55 ℃恒溫水浴10 min，置于冰水浴2 min終止反應，然后加入3 mL DNS試劑，混勻，沸水浴中煮沸10 min，取出冷卻至室溫，取2 mL反應液用蒸餾水定容至10 mL，以蒸餾水代替酶液為空白，在540 nm處測定吸光度，計算酶活力,如公式(1)：

(1)

式中:E，樣品溶液吸光度；n，樣品溶液的稀釋倍數；5，2 mL反應液換算成10 mL的倍數；6，10 min反應時間換算成1 h；h，標準曲線的斜率。

酶活單位定義為1 mL酶液最適條件下1 h水解質量分數1%可溶性淀粉液生成1 mg麥芽糖為1個酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.4 重組酶的酶學性質

最適溫度，以5 ℃為1個間隔，分別測定純化后β-淀粉酶酶液在40 ～70 ℃下的酶活力值(每次測定設置3份平行樣，下同)，設酶活力值最高值為100%，計算其他溫度下的相對酶活，以確定最適溫度。

最適pH，采用不同pH的緩沖液體系配制底物反應緩沖液，以0.5個pH單位為一個間隔，分別測定β-淀粉酶在pH 3～8的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算其他pH下的相對酶活，以確定最適pH。

溫度穩定性，將β-淀粉酶酶液分別在50和 60 ℃ 條件下處理不同時間再測定酶活，以未經過熱處理的酶液作為對照，測定其反應液在540 nm處的吸光度，并將其酶活值設為100%，不同處理時間下的酶活值除以最大值所得百分數即為該處理時間下的剩余酶活。剩余酶活降低至50%時所需的時間即為酶活力半衰期。

1.2.5 糖化實驗

配制質量分數為30%的麥芽糊精樣品4份，調溶液pH值至5.5并在55 ℃下預熱一段時間，分別加入50 U/g(干基)的重組β-淀粉酶、1 U/g的普魯蘭酶和50 U/g(干基)的重組β-淀粉酶、50 U/g(干基)的大麥β-淀粉酶和50 U/g(干基)商品β-淀粉酶，于恒溫水浴鍋中55 ℃糖化48 h，定時取樣用高效液相色譜檢測麥芽糖生成量。

1.2.6 高效液相色譜分析條件

首先對糖液樣品進行70%乙醇沉淀處理，靜置2 h 后離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔膜過濾后進樣。色譜條件：Agilent Waters X-Bridge氨基柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；示差檢測器；流動相乙腈體積分數為75%；流速1 mL/min；柱溫：室溫。麥芽糖生成率以生成的麥芽糖總量除以麥芽糊精(絕干)總質量表示。

2 結果與分析

2.1 重組菌的構建與鑒定

將PCR擴增得到的amyB基因與線性化的在質粒載體進行連接反應并轉化大腸桿菌，篩選得到片段與載體成功連接的陽性轉化子并進行雙酶切驗證，結果如圖1-A所示，可以看出片段大小在1.6 kbp處，與目的片段大小相符，說明重組表達載體pP43NMK-amyB構建成功。將其轉化枯草芽孢桿菌WB800，菌落PCR結果如圖1-B，其中約80%為陽性轉化子，將轉化子接種至含kan的液體培養基中可正常生長，說明重組枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800/pP43NMK-amyB(WB-amyB)構建成功。

A-重組質粒pP43NMK-amyB的雙酶切電泳圖；B-重組枯草芽孢桿菌WB800菌落PCR結果圖1 重組菌的構建與驗證Fig.1 Construction and verification of recombinant B. subtilis WB800/pP43NMK-amyB注：M-DNA分子質量標準; 圖1-A中，1-pP43NMK-amyB的雙酶切；圖1-B中，1～10-單菌落編號。

2.2 重組菌的發酵產酶進程

在1 L三角瓶中進行重組菌的發酵實驗，定時取樣測定OD600與酶活力，結果如圖2所示。重組菌WB-amyB在培養12 h后進入對數生長期，生長至24 h 后菌體進入穩定期，生長速率維持穩定，β-淀粉酶酶活力不斷上升，說明重組菌進入穩定期后能夠持續地合成與分泌β-淀粉酶。在培養約80 h時產酶水平達到峰值，此時酶活力值為386 U/mL，此后酶活力值稍有減低，之后基本維持不變，即培養80 h為最佳產酶時間。

圖2 重組菌的生長曲線與產酶曲線Fig.2 Growth curve and enzyme production curve of recombinant strain

2.3 重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的分離純化

搖瓶發酵約80 h時將發酵液離心收集上清液，首先采用鹽析的方法對上清液進行粗提純。分別加入飽和度為10%～70%的(NH4)2SO4，測定每一步中上清液與沉淀的酶活力，得到鹽析曲線如圖3所示，可以看出當(NH4)2SO4飽和度為20%時β-淀粉酶開始析出，60%時完全析出。所以在進行鹽析提純時先加入20%飽和度的(NH4)2SO4去除雜蛋白，離心棄沉淀后再向上清中加入40%的(NH4)2SO4，收集沉淀并用去離子水復溶，得到的樣品透析過夜之后采用QHP陰離子交換柱純化蛋白樣品。純化過程中測定每個步驟酶的比活力與回收率，結果如表1所示，可以看出經過QHP離子交換純化后酶的比活力達到613 U/mg，回收率為41%。同時采用凝膠色譜柱Superdex G75對同一品種大麥β-淀粉酶制劑進行純化[10]。收集重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的蛋白洗脫峰進行SDS-PAGE驗證，結果如圖4所示，可以看出純化后的重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶均為單一條帶，大小約為59 kDa。

表1 重組枯草芽孢桿菌分泌β-淀粉酶純化過程Table 1 Purification process of β-amylase produced by recombinant B.subtilis

圖3 (NH4)2SO4分級沉淀提純重組β-淀粉酶Fig.3 Purification of recombinant β-amylase by ammonium sulfate fractional precipitation

M-蛋白質標準分子質量；1-含空質粒的枯草芽孢桿菌發酵液；2-含重組質粒的重組枯草芽孢桿菌發酵液；3-純化后的重組β-淀粉酶；4-純化后的大麥β-淀粉酶圖4 純化的重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶SDS-PAGE結果Fig.4 SDS-PAGE results of recombinant β-amylase and barley β-amylase

2.4 重組酶的酶學性質

分別測定和比較了純化后重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的比酶活以及最適溫度、最適pH值和50、60 ℃條件下的溫度穩定性，結果如表2與圖5所示。純化后的重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的比酶活分別為613和661 U/mg，說明枯草芽孢桿菌分泌表達的重組β-淀粉酶的催化性質沒有改變。

表2 大麥β-淀粉酶與重組β-淀粉酶的酶學性質比較Table 2 Comparative of enzymatic properties between recombinant β-amylase and purified barley β-amylase

將純化后的β-淀粉酶在不同溫度下反應10 min測定其最適反應溫度。從圖5-A可以看出重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的最適溫度均為55 ℃，且在溫度高于55 ℃后酶活迅速下降，重組β-淀粉酶在65 ℃ 下的相對酶活約為40%。

將純化后的β-淀粉酶用不同pH的磷酸鹽緩沖液稀釋后測定其相對酶活。從圖5-B中可以看出重組β-淀粉酶的最適pH值為5.0，其在pH 3.5～5.5能保持較高的酶活力，在pH>5.5時酶活力下降明顯。而大麥β-淀粉酶的最適pH值 為6.0，在pH 4.5～7 相對酶活能維持在80%左右。與大麥β-淀粉酶相比，重組β-淀粉酶的最適pH降低了1.0，且在pH 3～5的相對酶活也要高于大麥β-淀粉酶，其適應的pH范圍也向酸性方向發生了偏移。這說明枯草芽孢桿菌重組表達的β-淀粉酶的耐酸性增強了。

將純化后的β-淀粉酶分別放置在50、60 ℃條件下，每隔10 min取樣測其相對酶活，得到溫度穩定性曲線，結果如圖5-C與圖5-D所示。由圖5-C可以看出重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶在50 ℃條件下作用時酶活力均緩慢下降，作用80 min后仍能保持60%左右的酶活力，且50 ℃條件下大麥β-淀粉酶的溫度穩定性稍優于重組β-淀粉酶。由圖5-D可以看出60 ℃條件下作用時大麥β-淀粉酶的熱失活曲線也比重組β-淀粉酶稍微緩慢，重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶在60 ℃時的半衰期分別為49和41 min，60 ℃作用1 h后酶活力殘留30%和40%。

2.5 重組β-淀粉酶的應用效果

為了考察重組β-淀粉酶單獨使用以及與普魯蘭酶聯合使用的實際應用效果，以質量分數30%的麥芽糊精作為底物溶液進行水解實驗。并以大麥β-淀粉酶、商品β-淀粉酶作為對照，麥芽糖生成量采用高效液相色譜進行定量檢測，結果如圖6所示。

A-最適溫度；B-最適pH；C-50 ℃溫度穩定性；D- 60 ℃溫度穩定性圖5 純化的大麥β-淀粉酶與重組β-淀粉酶的酶學性質比較Fig.5 Comparative of enzymatic properties between recombinant β-amylase and purified barley β-amylase

圖6 不同來源β-淀粉酶水解麥芽糊精產生麥芽糖過程Fig.6 Maltose production from maltodextrin hydrolyzed by different sources of β-amylase

添加相同酶活的重組β-淀粉酶、大麥β-淀粉酶水解生成麥芽糖的能力相似，其麥芽糖最終轉化率分別為60.77%和62.41%，而商品來源β-淀粉酶的麥芽糖轉化率則為55.04%，略低于前兩者，這說明枯芽孢桿菌重組表達的β-淀粉酶完全可以替代大麥β-淀 粉酶的作用。在重組β-淀粉酶中添加普魯蘭酶之后，可明顯提高麥芽糖的生成速率以及轉化率，在相同的條件下添加普魯蘭酶的重組β-淀粉酶的麥芽糖最終轉化率達到81.87%，說明重組β-淀粉酶與普魯蘭酶聯用達到的效果可以滿足高麥芽糖漿的生產。

3 討論

β淀粉酶主要來源于植物和微生物，如大麥，甘薯，芽孢桿菌等。植物來源的β-淀粉酶通常具有更高的耐熱性和催化活性，但是其提取效率低、成本高且受季節因素影響。微生物來源的β-淀粉酶在生產上不受季節的影響，更適合規?；a和自動化控制[17]，因此使用微生物表達植物來源β-淀粉酶成為淀粉酶應用領域中的一個重要目標。而枯草芽孢桿菌本身就有產淀粉酶系的菌株，且發酵條件簡單，細胞生長密度高，分泌蛋白能力強，因此枯草芽孢桿菌是異源表達β-淀粉酶的理想宿主。

本研究將大麥來源的β-淀粉酶基因amyB導入枯草芽孢桿菌WB800，構建的重組菌WB-amyB可以穩定分泌表達β-淀粉酶，將本研究與其他異源表達的β-淀粉酶研究相比較，結果見表3。

在異源表達大麥β-淀粉酶的研究中，目前未見文章報道過在枯草芽孢桿菌中實現大麥β-淀粉酶的異源表達，枯草芽孢桿菌是一種食品安全的宿主，其表達的重組酶可直接分泌到胞外，便于酶的提純。本研究以枯草芽孢桿菌WB800作為宿主，在搖瓶發酵水平中的酶活力值可以達到386 U/mL，高于已有文獻報道[8,18-20]。重組β-淀粉酶的酶學性質與大麥β-淀粉酶相比幾乎相同，保留了大麥β-淀粉酶相對較好的耐熱性與穩定性，且重組β-淀粉酶在偏酸性的環境中穩定性更強，因此在需要耐酸性β-淀粉酶的工業中具有一定的應用潛力。重組β-淀粉酶水解產生麥芽糖的能力與大麥β-淀粉酶相當，與普魯蘭酶聯用時麥芽糖轉化率可達81.8%，可直接用于生產高麥芽糖漿。

表3 不同來源β-淀粉酶表達情況的比較Table 3 Comparison ofexpression properties of different sources of β-amylase

有文獻報道采用大腸桿菌異源表達的植物β-淀粉酶熱穩定性下降，容易被降解而失去活力[10-11]，采用畢赤酵母作為宿主異源表達的β-淀粉酶雖然酶學性質沒有發生改變，但是酵母表達系統難以實現淀粉酶水解酶系的異源高表達，其原因尚不清楚[23]?？莶菅挎邨U菌表達的異源蛋白一般通過普通分泌途徑(Sec)分泌到胞外，在蛋白穿膜之后，信號肽酶會切除信號肽，使蛋白質折疊成正確的構象[24]，而大腸桿菌表達異源蛋白時一般為胞內表達，不存在跨膜過程，因此異源蛋白可能會出現錯誤的折疊，且大腸桿菌在表達異源蛋白時容易形成包涵體，酶的性質可能也會因此受到一定的影響。

本研究僅測定了重組枯草芽孢桿菌在搖瓶發酵水平上的產酶活力，下一步將采用罐式發酵對發酵條件進行探究，使重組枯草芽孢桿菌產酶量進一步提高。此外，對大麥β-淀粉酶基因改造的研究一直以來也頗受關注，有學者通過比對不同熱穩定性的大麥等位基因，采用定點突變的方法提高了大麥β-淀粉酶的熱穩定性與催化活性[25]，另外還有學者通過移除大麥β-淀粉酶C末端4個富含甘氨酸的片段發現其與底物的親和力以及熱穩定性都有了顯著提高[26]。本研究所表達的大麥β-淀粉酶基因來自于一株野生大麥品種Haruna Nijo (GenBank：BAA04815.1)。故在枯草芽孢桿菌異源表達的基礎上可通過氨基酸序列比對等手段對其基因序列進行改造，提高其穩定性與催化活性，從而獲得性質更加優良的重組β-淀粉酶。