力學刺激對軟骨細胞Cdc42基因表達及表型的影響

吳 猛 應 俊 馬 旺 沈施耘 李雄峰

軟骨細胞退變導致軟骨剝脫缺損是骨性關節炎常見的表現，對一些年輕的患者采用軟骨修復的方式可以恢復關節功能，延緩關節置換的時間。但目前采用的自體軟骨移植，只能修復較小范圍的缺損，對于較大面積的缺損，往往需要進行體外擴增，目前雖有一些實驗室能進行自體軟骨細胞體外擴增后，應用于臨床，但價格昂貴，未能普及。同時軟骨細胞在體外傳代過程去分化不能維持表型穩定的現象，是軟骨細胞體外大規模擴增培養的瓶頸。在以往的研究中發現適合的力學刺激能延緩軟骨細胞去分化，并使去分化的軟骨細胞恢復部分功能，但不能長久有效的維持，研究中還發現軟骨細胞在力學刺激下細胞骨架的變化可能和軟骨細胞表型的維護有一定的關系[1,2]。

Cdc42蛋白是細胞內一種具有重要功能的蛋白質，對細胞生長的促進、細胞骨架結構的調節、細胞極性的維持及承擔細胞內運輸等多種功能，并可能具有調節軟骨細胞的形態及其功能的作用，本研究對力學刺激下Cdc42的表達變化及對軟骨細胞表型穩定性的影響進一步分析，并探討二者之間的關系。

材料與方法

1.實驗試劑和儀器： DMEM高糖培養基，胰酶(美國Gibico公司)；Ⅱ型膠原酶(美國CalBioche公司)；胎牛血清(美國Gibico公司)；Ⅰ型膠原鼠抗單克隆抗體(美國CalBioche公司)；Ⅱ型膠原鼠抗人單克隆抗體(美國CalBioche公司)；反轉錄試劑盒(德國QIAGEN公司)；TRIZOL(美國Gibico公司)；Go-Taq?qPCR Master Mix(美國Promega公司)；細胞培養箱(美國Thermo Forma 311公司)；倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)；PCR儀(德國Eppendorf AG公司)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；移液器(德國Eppendorf AG公司)；Flexcell?FX-5000TMTension System購自美國。PCR引物序列(上海生工Sangon Biotech公司)。

表1 PCR引物序列

2.軟骨細胞的獲取:取健康的2周齡SD大鼠12只，體重0.10～0.15kg(浙江中醫藥大學醫學實驗動物中心提供)。苯巴比妥鈉腹腔麻醉后處死，消毒后無菌分離髖關節、用鑷子取下大鼠股骨頭軟骨帽。將軟骨在PBS的培養皿中反復漂洗數次后剪碎成1mm左右的軟骨塊，再用含青鏈霉素的PBS漂洗3次。加入適量0.25%胰酶，37℃消化大約1h后終止，最后加入0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃消化4～6h，在倒置相差顯微鏡下觀察到有較多游離的軟骨細胞后，加入含10%小牛血清的DMEM培養基終止消化。將細胞反復吹打后濾網過濾，收集濾液，2500r/min，離心5min,棄上清液，加入PBS制成細胞懸液，0.25%臺盼藍染色，活細胞大于90%即傳代培養。將原代軟骨細胞分別以4×105/cm3密度接種在25ml的細胞培養瓶中，當細胞鋪滿培養瓶底后用0.25%胰酶消化1∶2傳代培養。然后樣品在0.5%的瓊脂，10V/cm電泳45～60min。成像系統成像分析，攝片記錄。

3.P0～P3代軟骨細胞RT-PCR表型的鑒定:將培養的P0、P1、P2、P3代軟骨細胞，細胞用0.25%胰酶消化，PBS洗2次，調整細胞量后加入1ml Trizol提取細胞總RNA。PCR反應體系為：10×PCR buffer 5μl，上下游引物各1μl，cDNA模版1μl，10mmol/L dNTP1μl，ExTaq DNA聚合酶0.5μl，加入水至反應體系達50μl。反應條件為：上機94℃ 2min，55℃ 1min，72℃ 2min為第一步1個循環 94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 1min，第二步35個循環72℃ 10min，4℃ 5min冷卻后電泳。β-actin隨目的基因的條件而擴增,PCR引物序列詳見表1。

4.細胞牽拉裝置Flexcell?FX-5000TMTension System工作的原理以及力學刺激的大小、頻率和時間:Flexcell?FX-5000TMTension System利用橡膠密封墊在細胞培養板基膜與基座之間形成封閉腔，把此密封腔放入CO2培養箱中，然后使用活塞形成負壓，進而拉伸培養板底部彈性硅膠膜發生形變，使貼壁細胞受到拉伸而發生形變而產生效應，壓力大小可以通過計算機控制系統調節來改變基膜的形變量(圖1、圖2)。

圖1 Flexcell? FX-5000TM Tension System專用培養板和工作狀態圖

圖2 Flexcell? FX-5000TM Tension System

將第3代軟骨細胞放入Flexcell?FX-5000TMTension System專用細胞培養板中培養，當細胞生長鋪滿培養板孔時，更換培養基立即將細胞板放置在Flexcell?FX-5000TMTension System加載裝置上，給以形變幅度10%，頻率0.5Hz的力學刺激。軟骨細胞按刺激時間分組，分別給以0、3、6、9、12h的力學刺激，然后靜置6h后進一步做測試分析。

5.軟骨細胞總RNA的提取和體外擴增實時熒光定量分析:軟骨細胞在力學刺激后，細胞用0.25%胰酶消化，PBS洗2次，調整細胞量后加入1ml Trizol提取細胞總RNA。PCR反應體系為：10×PCR buffer 5μl，上下游引物各1μl，cDNA模版1μl，10mmol/L dNTP1μl，ExTaq DNA聚合酶0.5μl，加入水至反應體系達50μl。反應條件為：上機94℃ 2min，55℃ 1min，72℃ 2min為第一步1個循環 94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 1min，第二步35個循環72℃ 10min，4℃ 5min冷卻后電泳。β-actin隨目的基因的條件而擴增,PCR引物序列詳見表1。在RT-PCR 系統上進行擴增，以樣品和內參的比值代表相應基因表達水平的變化。

6.軟骨細胞的Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化檢測:力學刺激后的軟骨細胞，用4%多聚甲醛(PBS配置)室溫下固定10min,PBS洗2次，每次5min，3%的雙氧水處理10min，正常山羊血清封閉15min，滴加Ⅰ、Ⅱ型膠原(1∶100)一抗，4℃孵育過夜，室溫下復溫，PBS洗3次，每次2min，然后滴加二抗，DBA顯色，蘇木素套染后封片觀察。空白組采用PBS代替一抗，其余操作步驟相同。

7.軟骨細胞受到力學刺激后增殖能力的檢測:將受到不同時間力學刺激的軟骨細胞經0.25%胰蛋白酶消化后細胞5×104/ml分別接種于5塊96孔培養板中，每塊設6個復孔，放入培養箱中培養，隔日換液。加入5g/L的MTT液 20微升/孔，孵育4h后，棄去上清液后，加DMSO 200微升/孔，振蕩10min后在酶標儀上測吸光度(A)值，波長為490nm。取A值作為結果，在Excel表中繪制柱圖，來分析軟骨細胞的增殖情況。

結 果

1.軟骨細胞的培養觀察和鑒定:消化后大部分軟骨塊消失消化液內出現大量折光較強小圓形細胞，表明軟骨消化成功。軟骨細胞開始培養后10～12h開始貼壁，24～36h完成貼壁。其外形為大多為圓形、多邊形，呈明顯的鋪路石狀外觀或形成軟骨結節(圖3)。傳代后的細胞貼壁變快，3～5天即可鋪滿培養瓶，并有出現重疊生長現象。軟骨細胞可以分泌大量細胞基質，且基質沉積在細胞周圍將軟骨細胞互相連接起來，一般在7～10天即可在瓶底形成一層肉眼可見的膜狀組織，在細胞消化吹打時明顯可見。軟骨細胞在傳代過程和給以壓力后，其形態學變化不明顯。本實驗用RT-PCR和免疫組織化學染色分析軟骨細胞表型的表達，見軟骨細胞在P0～P3Ⅰ型膠原有微弱的表達，并有增強的趨勢，而Ⅱ型膠原表達早P0和P1比較強，傳代后有減弱的趨勢， Aggrecan表達情況和Ⅱ型膠原的表達相似(圖4)。P0代軟骨細胞的Ⅰ型、Ⅱ型膠原的免疫組織化學染色可見Ⅱ型膠原有較強的表達(圖5)，而Ⅰ型膠原的表達比較弱(圖6)。

圖3 原代軟骨細胞培養后形成軟骨結節(×200)軟骨細胞一般呈方形多邊形，立體感強，有很強的折光性

圖4 P0～P3代軟骨細胞Ⅱ型膠原、Aggrecan、Ⅰ型膠原的表達

圖5 原代軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組化可見大量陽性細胞，胞質深染

圖6 原代軟骨細胞Ⅰ型膠原免疫組化可見少量陽性細胞，胞質染色淺

2.CDC-42 Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原和Aggrecan qRT-PCR結果：Cdc-42在力學刺激9h時達到高峰(圖7)，其表達和0、3、6和12h比較，差異有統計學意義(P<0.01)。軟骨細胞Ⅰ型膠原在受到力學刺激0、3、6h未見明顯的變化，在9h后明顯升高，12h有下降，相對0、3、6h比較差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅱ型膠原和Aggrecan的RT-PCR的結果都在9h時達到一個峰值，然后出現下降，相對0、3、6h比較差異有統計學意義(P<0.01)，結果顯示Cdc-42的變化趨勢和Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和Aggrecan的變化趨勢基本一致(圖8～圖10)。

圖7 Cdc42在受到力學刺激后的變化與9h比較，#P<0.05；與12h比較，*P<0.05

圖8 Ⅰ型膠原受力學刺激后的變化與9h比較，#P<0.05；與12h比較，*P<0.05

圖9 Ⅱ型膠原受力學刺激后的變化與9h比較，#P<0.05；與12h比較，*P<0.05

圖10 Aggrecan 受力學刺激后的變化與3h比較，*P<0.05，與0h比較，#P<0.05;與6h比較，△P<0.05

3.軟骨細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化：軟骨細胞和Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化表明軟骨細胞在力學刺激的過程中，Ⅰ型膠原表達和Ⅱ型膠原在開始的0、3、6h表達較低，在9h表達陽性細胞明顯增多，胞質染色加深。詳見圖11、圖12。

圖11 力學刺激Ⅰ型膠原的免疫組化(×200)A.0h未受到力學刺激陽性表達情況；B.受到力學刺激9h時陽性細胞的表達情況

圖12 力學刺激Ⅱ型膠原的免疫組化(×200)A.0h未受到力學刺激陽性表達情況；B.受到力學刺激9h時陽性細胞的表達情況

在給予力學刺激，通過MTT法對軟骨細胞的增殖能力進行了檢測，發現軟骨細胞在各個時間段都出現了良好的增殖能力，軟骨細胞在6h和9h時出現了較好的增殖能力，但在軟骨細胞表型表達最高的9h時之前的6h時就出現較強的增殖能力，推測軟骨細胞的增殖能力在力學刺激后先出現增殖能力的增強后出現了表型的高表達(圖13)。

圖13 軟骨細胞在力學刺激后增殖能力的檢測與6h比較，*P<0.05；與9h比較，#P<0.05

討 論

關節疾病的根本原因就是軟骨退變和缺損，隨著體外細胞培養技術的進步，目前年幼年老的關節軟骨都可在體外培養出軟骨細胞，引起人們嘗試用自體軟骨細胞培養增殖修復軟骨缺損并達到完全具有生理意義上的功能恢復[3]。但通過自體關節軟骨在體內可獲取的軟骨非常有限，通過體外培養擴增獲得大量具有表型穩定性的軟骨細胞是軟骨組織工程修復軟骨缺損的重要基礎，軟骨細胞在體外進行單層貼壁培養的過程中，不能保持表型的穩定，因為目前對軟骨細胞在體外發生去分化的機制尚不明確，所以未能進行穩定的傳代培養而不利于軟骨組織工程軟骨的構建和骨性關節炎的發病機制的闡釋[4]。

如何保持軟骨細胞表型的穩定性是研究人員目前一直關注的課題，在筆者的研究中發現力學刺激能延緩軟骨細胞去分化的過程，動態的力學刺激能使去分化的軟骨細胞恢復部分功能，但不能長久有效的維持，并和軟骨細胞的細胞骨架的變化有一定的聯系[1]。如何維持軟骨細胞表型的穩定、提高軟骨細胞體外培養的擴增效率，使有大量的軟骨細胞應用于軟骨組織工程修復關節軟骨是目前研究的方向之一。但目前的研究還沒有有效的維持軟骨細表型穩定的方法，即使目前的經基因轉染永生化的軟骨細胞系，軟骨細胞也只能保持外形，在傳代過程失去分泌Ⅱ型膠原的功能表現為去分化狀態[5]。

一些激素或細胞因子被研究發現，它們在軟骨細胞的表型穩定性維持上有其一定的作用，并存在一定的相關性，如雌二醇和IL-β均有抑制正常軟骨細胞Ⅱ型膠原，但低濃度雌二醇卻能夠對抗IL-β的抑制作用[6]。Fibulin-3是一種細胞外基質蛋白，這種蛋白的過表達明顯抑制軟骨細胞的分化作用，同時抑制Sox5和Sox6，但對Sox9的表達沒有抑制作用，而Sox9被認為可能是軟骨細胞分化重要物質之一[7]。Collins-Racie等[8]發現目前在已知的48種細胞核受體中，有近2/3在軟骨細胞中可測出其表達，并且將分別從正常軟骨與骨性關節炎軟骨中提取的RNA樣本進行比較發現，有23種RNA的表達存在顯著性差異，這說明軟骨細胞發生變化和其內部基因和蛋白表達改變存在一定的關聯。

目前對軟骨細胞表型穩定性的維持的研究，主要有兩個方面：(1)改變軟骨細胞外在的生存條件，使用各種力學刺激包括機械的、液壓的動態和靜態的作用，觀察軟骨細胞表型的穩定和基質分泌情況[9]。使用三維載體培養或生物反應器對軟骨細胞進行培養均取得了一定的作用，加入一些細胞因子或化學物質也可以改變軟骨細胞的生存情況，使軟骨細胞能相對穩定的分泌Ⅱ型膠原和蛋白聚糖[10]。(2)改變軟骨細胞內在的功能，也能取得一定的作用，雖然基因轉染能克服軟骨細胞反復復制后的衰老現象，但也面臨著軟骨細胞表型不穩的難題[11]。在一些基因轉染的實驗中，改變細胞的功能，使細胞具有軟骨細胞的特征，如IGF-1轉染后能使骨髓基質干細胞和纖維細胞分泌Ⅱ型膠原[12, 13]。有研究發現軟骨細胞表型的穩定和糖化蛋白-N-聚糖唾液酸相關的α-2,6與α-2,3的比例有關，從而影響軟骨細胞分泌基質的功能[14]。而早期抑制軟骨細胞人組織蛋白酶K的表達，可使軟骨細胞Ⅱ型膠原和Aggrecan的分泌能力增加，使軟骨細胞的表型得以維持。可見軟骨細胞體外去分化的原因可能涉及細胞自身的因素和外在的生存條件，而軟骨細胞本身的原因是導致軟骨細胞在體外去分化的內因。因此,防止軟骨細胞去分化以及維持軟骨細胞的功能的關鍵問題，就是尋找導致軟骨細胞體外培養去分化的真正的分子機制。

Cdc42蛋白是Rho GTP酶家族中的一員，承擔著細胞多種生理功能，小分子蛋白GTP酶能調節軟骨細胞的形態和細胞骨架的變化而影響其功能[15]。Rho蛋白是一種屬于小G蛋白超家族，大小為21～22000的蛋白，在和GTP綁定時具有生物活性，而和GDP綁定時沒有生物活性，但可以相互轉化。而只有和GTP綁定時，GTP酶才能夠激活下游目標，引起細胞形態的變化和基因表達的變化，其中Cdc42激活后能促使細胞偽足形成細胞外基質黏附功能下降并影響軟骨細胞的細胞骨架的聚合[15]。而一些相關細胞因子，IL-1、IL-6、TNF-α等的研究也提示對軟骨細胞的表型的維持和軟骨基質的代謝有密切的關聯[16～19]。

防止軟骨細胞去分化以及維持軟骨細胞的功能的關鍵問題，就是尋找導致軟骨細胞體外培養去分化的真正的分子機制。軟骨細胞在力學刺激下GTP-Cdc42可能會在保持軟骨細胞的表型穩定性。Kira等[20]研究發現IL-1α、IL-6、IL-8能抑制Cdc42的活性，從而導致軟骨細胞表型的丟失。而細胞骨架actin的變化可以影響Cdc42的水平，在使用放線菌-D抑制細胞骨架actin的聚合后，Cdc42的表達下調，從而影響軟骨細胞表型的表達[21]。Rho家族蛋白，比如Rac，Rho和Cdc42亞家族，其功能就像分子的開關通過轉換不活躍的GDP綁定和活躍GTP綁定結構狀態調節一些傳導途徑。Cdc42具有一系列的功能，包括細胞骨架actin的組織、細胞的黏附、遷移、增殖和凋亡[22]。特異性Cdc42基因敲除的小鼠在胚胎期無法成活，其軟骨發育也存在變薄，增殖區軟骨細胞瘦小等特點，同時影響細胞骨架actin的重組，使細胞骨架排列紊亂[23]。Cdc42能決定性的影響出生后長骨的軟骨發育，并影響軟骨的骨化[24]。Wang等[25]研究表明Cdc42和骨發生沒有關系但和軟骨的發生密切相關，而其中BMP2/Cdc42/Pak/p38/Smad信號途徑可以是基質聚集，TGF-b/Cdc42/Pak/Akt/Sox9信號途徑有利于軟骨的分化。

本研究發現，軟骨細胞在受到力學刺激后，代表軟骨細胞的表型穩定性的Ⅱ型膠原和Aggrecan表現出和Cdc42變化的一致性，而代表軟骨細胞失去表型穩定性的Ⅰ型膠原表達也出現了一致性，可能是受到力學刺激后除了代表軟骨細胞表型的Ⅱ型膠原和Aggrecan表達增強，而代表軟骨細胞去分化的Ⅰ型膠原也出現了強表達，考慮可能是力學刺激軟骨細胞功能激活，導致一些炎性因子釋放和單層培養有關，石楊等[26]通過流體剪切力刺激軟骨細胞的研究也表明在一定條件下可以促使Ⅰ型、Ⅱ型膠原的表達上調。動態的力學刺激可能是通過刺激細胞釋放一些細胞因子,這些細胞因子IL-1、IL-6在軟骨細胞受到超過其生理負荷的刺激后使Cdc42的表達下調而使軟骨細胞表型的喪失，通過調節軟骨細胞Cdc42的而使軟骨細胞保持穩定，但這個穩定也有一定的條件，只有適合的力學刺激才能使軟骨細胞保持穩定的表型，這也是需要進一步研究的目標。