評價一種新CYP2C9突變型對藥物代謝的影響

亢奮恒 張博文 戴大鵬 李傳寶 蔡劍平

研究報道稱細胞色素P2C9(CYP2C9)是人類最重要的藥物代謝酶。細胞色素P2C9是P450酶家族中的重要成員，是肝微粒體中一種十分重要的藥物代謝酶，催化10%～20%臨床常用藥物在肝內的代謝[1,2]。大量研究表明，細胞色素P2C9具有眾多等位基因，大部分突變體蛋白的活性呈現明顯下降，是引起某些藥物代謝能力個體差異的重要原因[3,4]。

在1例常年口服低劑量(1.5～2.0mg/d)華法林患者體內發現了一種的新的細胞色素P450 2C9變異型，在1號外顯子32位發生了T>C突變，引起Leu11>Pro11的氨基酸改變。為探究其催化能力是否發生明顯改變，本研究引入甲苯磺丁脲作為探針藥。根據以往研究，作為其重要代謝底物之一的甲苯磺丁脲，在人體內代謝途徑單一，幾乎均由肝細胞色素P2C9催化代謝，是絕大多數細胞色素P2C9研究者必選的探針藥[5,6]。

現有研究表明，中國人群中最常見的細胞色素P2C9缺陷型突變體為細胞色素P2C9*3和*13，其中以*3最為多見，故本研究引入野生型* 1和突變型* 3 作為參照，通過對比3種細胞色素P2C9對底物藥甲苯磺丁脲的催化速率，以期指導該等位基因攜帶者的個體化用藥。

材料與方法

1.材料：(1)主要試劑：Trans5α化學感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)；DH10 Bac化學感受態細胞(美國 Invitrogen公司)；Spodoptera frugiperda昆蟲細胞，Sf-900TMⅢSFM昆蟲細胞培養基，胎牛血清及Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(美國Invitrogen公司)，Prime STAR MAX DNA聚合酶、DNA連接試劑盒(日本TaKaRa公司)，商業化CYP2C9微粒體及細胞色素b5微粒體(美國BD Gentest公司)，兔抗人CYP2C9多克隆抗體(英國AbD serotec公司)，小鼠抗人OR單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，HRP標記的羊抗兔及羊抗鼠二抗(北京中杉金橋公司)，蛋白定量及ECL顯色kit(美國Pierce公司)，甲苯磺丁脲(美國Sigma公司)，4-Hydroxytolbutamide(加拿大Toronto Research Chemicals公司)，NADPH生成系統(北京匯智泰康醫藥技術有限公司)，HPLC級溶劑(美國Fisher Scientific公司)，其余常規試劑均為優級純或分析純。(2)主要儀器：冷凍離心機、高速冷凍離心機(日本Kubota公司)，PCR擴增儀(美國ABI公司)、細胞超聲破碎儀(美國 Sonic公司)，電泳儀及水平電泳槽(美國Bio-Rad公司)、Tanon 5200化學發光成像系統(上海天能科技有限公司)，Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，所用常規耗材均購自美國Axygen公司。

2.CYP2C9基因定點誘變和ORF區擴增引物設計：根據NCBI公布的CYP2C9全基因組序列(NM 000771.3)，利用Primer 5.0軟件設計開放閱讀框(ORF)區擴增引物、突變位點相應的上下游寡核苷酸引物(分別命名為-2F和-1R)以及測序引物(表1)，引物由北京天一輝遠公司合成。

3.pFastBac-dual-OR-2C9雙表達載體的構建：將美國Origen公司購買的細胞色素P450氧化還原酶(CYPOR)的ORF區擴增，擴增產物切膠回收，回收之后進行XhoⅠ/KpnⅠ雙酶切，再將產物與同樣雙酶切的空載體 pFastBac-dual連接，即獲得可接收 CYP2C9 擴增產物的中間載體pFastBac-dual-OR。利用重疊延伸PCR技術，以細胞色素P2C9*1質粒為模板，獲得細胞色素P2C9*3、細胞色素P2C9(32T>C)的cDNA全長[7,8]。將細胞色素P2C9的cDNA區擴增產物切膠回收后進行EcoRΙ/SalΙ雙酶切，與同樣酶切的中間載體pFastbac-dual-OR(含CYPOR的結構基因)連接，連接產物轉化Trans5α化學感受態細胞后用PCR法篩選陽性克隆，挑取陽性克隆隔夜搖菌，提取質粒后送北京天一輝遠公司進行序列測定，以確認所獲載體中定點誘變位點堿基與設計完全一致。

表1 構建CYP2C9重組質粒載體的引物

下劃線處序列為限制性內切酶切割位點，下劃線處堿基為突變位點；CYP2C9(32T>C)突變位點為1號外顯子第32位，CYP2C9*3突變位點為7號外顯子第1075位

4.桿粒載體Bacmid-OR-CYP2C9s的制備及PCR驗證：陽性重組質粒轉化DH10bac感受態細胞以后，篩選陽性克隆，挑取陽性克隆隔夜搖菌，利用桿狀病毒穿梭載體bacmid抽提試劑盒提取重組桿粒DNA，并進行PCR驗證，驗證所用引物如下(表2)。

表2 對重組桿粒載體進行PCR驗證的正向和反向引物

5.桿狀病毒的獲得和增殖：參照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System試劑盒使用說明，包裝Bacmid-OR-CYP2C9昆蟲病毒，所獲病毒侵染偽黏蟲卵巢細胞，觀察細胞在不同生長階段的特征(表3)，在轉染后期階段收集P1代病毒，利用獲得的P1代病毒繼續擴增產生P2代病毒。

表3 病毒侵染后的偽黏蟲卵巢細胞不同生長階段顯微鏡下特征

6.高表達細胞色素P2C9昆蟲微粒體的獲得：將P2代病毒上清繼續培養，72h后離心收集細胞，洗滌后重懸于5ml重懸液(0.25mol/L蔗糖，1mmol/L EDTA，0.5mmol/L PMSF)中，利用超聲破碎儀進行破碎，破碎產物經12000g 離心后去除細胞碎片，將得到的上清經100000g超速離心，再將得到的沉淀物(微粒體)重懸于微粒體儲存液中，凍存于-80℃冰箱。

7.使用免疫印跡法對重組細胞色素P2C9突變型蛋白進行鑒定：用BCA法測定微粒體蛋白濃度，取5μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后樣品轉移至PVDF膜，用封閉液封閉，封閉后進行一抗孵育(一抗選擇兔抗人CYP2C9抗體和鼠抗人CYPOR抗體)，4℃條件下孵育過夜，次日將PVDF膜取出洗滌后進行二抗孵育(二抗選擇山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG)，滴加曝光液后用化學發光圖像分析系統進行檢測。

8.LCMS/MS檢測細胞色素P2C9對甲苯磺丁脲的代謝：(1)催化體系：由重組細胞色素P2C9蛋白、細胞色素b5、NADPH輔酶、Tris-HCl以及甲苯磺丁脲組成200μl反應體系。(2)催化過程：37℃孵育1h后，加入氯磺丙脲和HCl，置于渦旋震蕩器震蕩 2min，加入冰乙酸乙酯繼續渦旋震蕩2min，離心后轉移有機層，用氮吹儀吹干，加入100μl流動相復溶并取20μl于Agilent 1200高效液相色譜儀檢測。(3)色譜檢測條件：色譜柱為ZORBAX EclipseXDB-C18柱(4.6mm×150.0mm，5μm，美國Agilent公司)，流動相為0.05%TFA∶乙腈=70∶30，流速為0.4ml/min，柱溫40℃，上樣體積為2μl，內標為氯磺丙脲。(4)最大反應速度Vm及米氏常數Km值的計算：根據標準曲線，將代謝產物4-Hydroxytolbutamide定量后，利用Prism軟件(version 5，美國GraphPad公司)計算Vm、Km值以及清除率(Vm/Km)。

結 果

1.對新細胞色素P2C9突變體重組質粒進行測序驗證：以CYP2C9-EF和CYP2C9-SR為引物，將提取的pFastBac-dual-OR-2C9重組質粒送北京天一輝遠公司測序，測序結果用Oligo7軟件進行序列分析，箭頭所指處顯示，堿基T→C誘變成功(圖1)。

圖1 細胞色素P2C9新突變型重組質粒測序結果

2.利用瓊脂糖凝膠電泳技術對重組質粒載體進行鑒定：將提取的pFastBac-dual-OR-2C9重組質粒進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳，大小約1500bp(圖2)。

圖2 重組細胞色素P2C9質粒載體PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

3.使用免疫印跡法對重組細胞色素P2C9突變型蛋白進行定性檢測：免疫印跡結果顯示，在同一張PVDF膜55000與78000左右出現以下兩個條帶(圖3)，與目標蛋白相對分子質量接近，箭頭以上條帶為細胞色素P2C9(相對分子質量約為53000～55000)，箭頭以下條帶為細胞色素P450氧化還原酶(相對分子質量約為78000)。

圖3 免疫印跡法檢測重組細胞色素P2C9微粒體蛋白STD.購自美國BD Gentest公司的CYPC29標準品;OR.只表達細胞色素P450氧化還原酶的陰性對照

4.使用免疫印跡法對重組細胞色素P2C9突變型蛋白進行定量檢測：將美國BD Gentest公司購買的細胞色素P2C9*1微粒體標準品梯度稀釋為2.4、1.2、0.6和0.3pmol/μl 4種不同濃度(圖4)，利用Image J軟件進行灰度分析后，經對比定量計算，重組微粒體細胞色素P2C9*1、重組細胞色素P2C9*3、重組細胞色素P2C9(32T>C)濃度分別為：2.256、2.103、2.434pmol/μl。

圖4 免疫印跡法對重組細胞色素P2C9進行定量檢測S1～S4分別為2.4、1.2、0.6、0.3pmol/μl 4種不同濃度的CYP2C9標準品

5.細胞色素P2C9(32T>C)對甲苯磺丁脲的催化活性：體外代謝檢測結果表明，細胞色素P2C9(32T>C)對于甲苯磺丁脲的清除率為野生型*1的12.40%，差異有統計學意義(表4)。細胞色素P2C9(32T>C)對甲苯磺丁脲的清除率明顯低于野生型，接近典型突變型*3(圖5)。

表4 細胞色素P2C9催化甲苯磺丁脲代謝的酶動力學參數

與CYP2C9*1比較，*P<0.05

圖5 細胞色素P2C9催化甲苯磺丁脲的酶促動力學曲線圖

討 論

作為人體肝臟中一種非常重要的藥物代謝酶，細胞色素P2C9不僅含量豐富(約占細胞色素P450總量的20%)，而且可以催化眾多不同類型藥物的代謝[9～12]。從中選擇哪些藥物作為研究的底物藥，是首先要考慮的問題。雖然該突變型是從1例華法林慢代謝型患者身上發現的，但由于人體對華法林的代謝受多種因素影響，除了細胞色素P2C9以外，VKORC1的基因多態性也具有重要影響[13,14]。本研究僅對攜帶者CYP2C9基因編碼區的9個外顯子進行測序，并不知道VKORC1等基因的變異情況。因此，單獨研究細胞色素P2C9對華法林的代謝功能，對于患者個體化用藥的指導意義并不是很大。相比之下，甲苯磺丁脲在人體內代謝途徑單一，80%以上在肝內被細胞色素P2C9羥化代謝，是體外研究細胞色素P2C9活性的絕佳底物藥[15]。

與其他細胞色素P450家族比較，細胞色素P2C9的等位基因在人群中存在高度的遺傳多態性，目前已被統計命名的有60種，其中最常見的突變型是*2和*3，它們和野生型細胞色素P2C9*1是目前研究最多的3種型別[16～19]。中國人群中最常見的突變類型是*3與*13，其中以*3最為多見，故本項研究選擇了我國人群中最多見的細胞色素P2C9基因型*1和*3作為參照，通過對比對細胞色素P2C9(32T>C)新突變型的催化功能作出評價。

Western blot法檢測結果表明，細胞色素P2C9(32T>C)的蛋白表達量與野生型比較，差異無統計學意義，說明該變異基因并未影響蛋白質的正常表達。體外藥物代謝檢測結果顯示，細胞色素P2C9*3的清除率為9.09%，與以往研究結果相似，說明在同等條件下測得的細胞色素P2C9(32T>C)的催化活性具有一定的可信度。細胞色素P2C9(32T>C)對于探針藥物甲苯磺丁脲的體外清除率為細胞色素P2C9野生型的12.40%，略高于細胞色素P2C9*3(表4)。酶促反應曲線顯示細胞色素P2C9(32T>C)對甲苯磺丁脲的催化能力接近于典型突變型細胞色素P2C9*3，酶學活性明顯下降，提示攜帶該基因型的患者服用經由細胞色素P2C9代謝的藥物時，體內藥物代謝速率可能會發生不同程度的降低，用藥時忽視這一點可能會造成藥物在體內蓄積，引發不良反應甚至毒性反應(圖5)。

以往研究表明，細胞色素P2C9的催化作用具有底物依賴性，即對不同底物呈現出不同程度的活性改變，提示細胞色素P2C9(32T>C)在催化其他種類藥物代謝時可能會表現出不同的活性。本項研究選用細胞色素P2C9的特異性探針藥甲苯磺丁脲作為檢測活性的底物藥，雖然對臨床用藥具有重要的指導作用，但仍然有必要開展大量體內及體外實驗進一步全面研究該突變型的催化功能。