SLCO1B1多態性及脂代謝與糖尿病腎病的相關性研究

趙 玲 柯亭羽 郭 佳 李孔龍 潘 毅 王 曦

糖尿病腎病是2型糖尿病的主要慢性并發癥之一，其降低了患者的生活質量,增加了糖尿病病死率，給衛生保健系統造成了沉重的負擔。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)患者出現腎功能不全后，其腎功能惡化的進展速度較一般腎小球腎炎快，接受腎臟替代治療時的預后也比一般慢性腎臟疾病差[1]。所以DN的早期診斷、治療及高危人群的篩查顯得尤為重要。高血糖是DN發生、發展的重要因素，但卻不是唯一因素。DN的發生、發展還與復雜的遺傳背景相關，這可能部分歸因于遺傳易感性[2]。本研究就SLCO1B1基因多態性及脂代謝在2型糖尿病腎病發病中的作用進行研究。

對象與方法

1.對象:(1)對照組：選取2016年于昆明醫科大學第二附屬醫院心內科因高血壓或者冠心病住院的患者共66例，均無內分泌疾病及糖尿病家族史。(2)2型糖尿病非腎病及腎病組：選取2016年于昆明醫科大學第二附屬醫院住院的2型糖尿病患者100例，按尿白蛋白/肌酐比值(albumin /creatinine ratio，ACR)再分為2型糖尿病未合并腎病組即DN(-)組，共60例；2型糖尿病腎病組即DN(+)組，共40例。

2.診斷標準:(1)糖尿病的診斷標準:采用1999年WHO提出的糖尿病診斷標準：①糖尿病癥狀(典型的糖尿病癥狀包括多尿、多飲和無法解釋的體重降低)，任意時間血漿葡萄糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)；②空腹(空腹是指無熱量攝入至少8h)血漿葡萄糖≥7.0mmol/L(126mg/dl)；③口服葡萄糖耐量實驗，葡萄糖(75g無水葡萄糖)負荷后2h血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)。(2)糖尿病腎病診斷標準:2014 年美國糖尿病協會(American Diabetes Association，ADA)與美國腎臟病基金會(National Kidney Foundation，NKF)達成共識，認為 DKD(diabetic kidney disease)是指由糖尿病引起的慢性腎病，主要包括腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)低于60ml/(min·1.73m2)或尿白蛋白/肌酐比值(ACR)>30mg/g持續超過3個月。 本研究將ACR>30mg/g定義為糖尿病腎病。

3.排除標準:(1)1型糖尿病患者。(2)嚴重的心臟、肝、腎衰竭患者。(3)藥物中毒，感染和多發性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、尿路感染、輸尿管結石和腫瘤、腎臟疾病等可能引起蛋白尿的疾病。(4)24h內有劇烈運動者。(5)有放射線接觸史者。(6)孕婦或者哺乳期者。(7)各受試對象間有血緣關系。

4.標本和臨床資料的采集:(1)姓名、性別、年齡、身高(cm)、體重(kg)、計算體重指數(BMI=體重/身高2，kg/m2)、糖尿病病程、用藥史。(2)所有研究對象空腹8h后清晨采集靜脈血4ml用于測定甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、肝功能、腎功能指標。(3)采集晨尿測定尿液分析+尿沉渣定量、尿微量白蛋白。(4)尿蛋白定性及尿微量白蛋白異常的患者還收集24h尿蛋白定量結果。(5)采集2ml靜脈血加入EDTA抗凝劑，用于DNA的提取、PCR擴增，進行ApoE、SLCO1B1基因多態性分析。

5.檢測方法及原理:多重熒光定量PCR技術，基于熒光定量PCR平臺，首先針對SNP位點上下游設計特異性引物，分別針對野生型及突變型位點設計不同熒光基團標記的特異性探針，然后對引物及探針進行科學的配比組合，配置SNP位點檢測體系，通過熒光定量PCR儀對臨床樣本DNA進行PCR擴增，同時收集擴增信號，如果信號為野生型探針信號，那么樣本為純合野生型；如果信號為突變型探針信號，那么樣本為純合突變型；如果信號同時有野生型及突變型探針信號，那么樣本為雜合突變型。

結 果

1.3組間血脂的比較:3組人群的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇經單因素方差分析，發現高密度脂蛋白膽固醇比較，差異有統計學意義(P<0.05)，進而采用LSD法進行兩兩比較發現，對照組和DN(+)組(P=0.040)、DN(-)組和DN(+)組(P=0.013)高密度脂蛋白膽固醇比較，差異有統計學意義。DN(-)組和DN(+)組血脂比較，兩組患者的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋膽固醇白經兩獨立樣本t檢驗，發現DN(+)組高密度脂蛋白膽固醇水平低于DN(-)組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

2.SLCO1B1基因多態性與2型糖尿病腎病:3組人群SLCO1B1基因型頻率比較:(1)3組人群388A>G、521T>G位點基因型分布情況,詳見表2、圖1。(2)SLCO1B1基因388A>G(χ2=1.709，P=0.750)和521T>G(χ2=1.786，P=0.755)的基因型頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 3組人群血脂比較

3組人群SLCO1B1 388A>G、521T>G位點等位基因頻率比較:(1)3組人群388A>G、521T>G位點等位基因分布情況,詳見表3、圖2。(2)3組患者組SLCO1B1等位基因頻率經χ2檢驗，388A>G(χ2=1.279，P=0.528)和521T>G(χ2=0.103，P=0.950)等位基因比較，差異無統計學意義。

3組人群SLCO1B1基因單倍型分析:(1)3組人群SLCO1B1基因單倍型分布詳見表4、圖3。(2)3組人群SLCO1B1基因單倍型頻率經χ2檢驗差異無統計學意義(χ2=1.237，P=0.872)。

表2 3組SLCO1B 1 基因型頻率比較 [n(%)]

圖1 SLCO1B1 388A>G、521T>C位點基因型頻率分布

表3 3組間SLCO1B 1388A>G、521T>G位點等位基因頻率比較[n(%)]

組別388A>G521T>GAGCT對照組34(25.76)98(74.24)15(11.36)117(88.64)DN(-)組32(26.67)88(73.33)15(12.50)105(87.50)DN(+)組16(20.00)64(80.00)9(11.25)71(88.75)合計82(24.70)250(75.30)39(11.75)293(88.25)

圖2 SLCO1B1 388A>G、521T>C等位基因頻率分布

表4 SLCO1B1基因單倍型頻率比較

組別*15*1a*1b合計對照組5(7.58)3(4.55)58(87.88)66DN(-)組4(6.67)4(6.67)52(86.67)60DN(+)組4(10.00)1(2.50)35(87.50)40合計13(7.83)8(4.82)145(87.35)166

圖3 SLCO1B1單倍體型頻率分布

討 論

OATP1B1基因是主要的肝臟轉入載體，在人體肝臟基底膜外側表達。其生理功能包括：介導肝細胞膜轉運內、外源性物質并對其進行代謝和消除。人類OATP1B1基因位于12號染色體的短臂21區2帶，全長108.59kb，包括15個外顯子和14個內含子，其編碼基因SLCO1B1的cDNA包含2073個堿基，編碼697個氨基酸，具有高度遺傳多態性。其中，被研究最多也是在亞洲人群中最常見的2個非同義突變為388A>G和521T>C，在中國人群中388A>G和521T>C的突變率分別為73.4%和14%。SLCO1B1基因(A388G)和(T521C)兩位點的非同義突變可隨機組合為3種單倍體類型：雙野生型(兩位點均沒有突變*1A(388A521T)、雙突變型(兩個位點均突變)*15(388G521C)和單突變型(只有1個位點突變)*1B(388G521T)或*5(388A521C)[3，4]。常見的521T>C位于蛋白跨膜區，可使 OATP1B1的與底物的親和力下降，轉運活性下降[5]。具有521T> C變異的單倍體，如SLCO1B1*5、*15～*17等，有相似的表型，所編碼的蛋白轉運功能下降。體內試驗已經發現攜帶521C等位基因的個體OATP1B1轉運活性下降，可減少多種藥物進入肝細胞的速率，阻礙藥物代謝[6]。388A>G，不僅構成SLCO1B1*1b，還存在于 SLCO1B1*15中(388G-521C)。SLCO1B1* 1b對轉運功能的影響還沒有一致的結論，部分研究認為它對蛋白的功能沒有影響，但一些研究認為會增強轉運作用。

目前，對SLCO1B1基因的研究主要集中于SLCO1B1基因多態性對藥物代謝、治療效果及相關不良反應方面的研究，其中以研究他汀類降脂藥及口服降糖藥療效的研究居多。而目前SLCO1BI與疾病相關性的研究甚少，有研究顯示SLCO1B1基因 388A>G和521T>C基因多態性與云南白族人群冠心病發病之間可能無相關性[7]。另一項研究同樣也顯示SLCO1B1 388A>G和521T>C的基因型和等位基因頻率以及SLCO1B1基因單倍體頻率在冠心病組和對照組比較，差異無統計學意義[8]。本研究顯示SLCO1B1 388A>G和521T>C的基因型和等位基因頻率以及SLCO1B1基因單倍體頻率在DN(-)、DN(+)組和對照組比較，差異無統計學意義，研究認為SLCO1B1 388A>G和521T>C位點基因多態性與2型糖尿病、2型糖尿病腎病無明顯的相關性。

糖尿病腎病的主要病理變化是腎臟高灌注、高濾過、腎小球基膜增厚以及腎小球系膜區為主的細胞外基質積累，導致彌漫性或結節性腎小球硬化。目前研究發現腎小球硬化與動脈粥樣硬化有相似的病理生理過程，均與血脂異常有關[9]。大量研究顯示2型糖尿病患者血脂紊亂和DN之間有著高度的相關性。研究發現合并高TG血癥及高LDL-C血癥的早期DN患者的尿微量白蛋白明顯高于未合并以上血脂紊亂者[10]。有研究顯示，糖尿病腎病各組與無腎病組比較，HDL-C明顯降低，隨著腎臟損害的加重，血脂紊亂加劇，表現為TG、TC、LDL-C、Apro-B逐步升高，而HDL-C、Apro-A逐漸降低[11]。本研究得到了與上述研究類似的結果，與DN(-)組比較，DN(+)組的高密度脂蛋白膽固醇明顯降低，Logistic回歸分析顯示，HDL-C降低是2型糖尿病腎病發病的危險因素。脂代謝紊亂導致糖尿病腎病的主要機制可能有以下幾種：(1)LDL-C與腎小球內膜下基質結合，發生氧化修飾與被巨噬細胞吞噬，引起泡沫細胞的形成，導致脂質沉積，與動脈硬化相似，腎小球硬化與巨噬細胞轉化為泡沫細胞有密切的聯系[12]。(2)HDL-C具有抗動脈粥樣硬化的作用。它能促進膽固醇的排泄，加速極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的代謝，防止動脈壁脂質的沉積，因此是防止動脈粥樣硬化的保護因子。當HDL-C降低時，可能促進腎動脈粥樣硬化的發生，導致糖尿病腎病。(3)纖溶酶活性可被脂蛋白競爭性抑制，通過腎小球毛細血管凝血和血栓形成，改變腎小球血流動力學，從而使缺氧、缺血加重[13]。(4)氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox LDL)有細胞毒性、促炎癥和免疫特性，可通過細胞毒性誘導細胞凋亡[14]。

近年來，研究者相繼發現了一些與糖尿病腎病有關的遺傳易感基因和易感染色體位點，這不僅有助于在分子水平認識糖尿病腎病的發病機制，同時還可能鑒定出高危人群，以利于早期診斷及防治、個體化藥物治療甚至進行基因治療[15]。因此，從遺傳學角度闡述2型糖尿病腎病對疾病的預診斷以及臨床治療意義重大。