成纖維細胞生長因子-21通過抑制EMT改善糖尿病腎纖維化

翁曉璐 林孫東 倪永青 何露露 盧學勉

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計，大約40%的DN患者都會發(fā)展為終末期腎病(ESRD)[1,2]。進行性的腎臟纖維化過程是DN的發(fā)展特點，基質蛋白的過表達導致的細胞外基質(ECM)的過度積累是其重要原因，其中結締組織生長因子(CTGF)，纖連蛋白1(FN1)和膠原蛋白(Col)都參與了這一過程[3,4]。研究表明，ECM沉積主要由上皮-間質轉化(EMT)誘導，EMT是一種上皮細胞轉分化為運動間充質細胞的過程，上皮細胞在維持正常腎結構和功能中起重要作用[5]。在EMT期間，上皮細胞逐漸失去頂端-基底極性后和細胞內粘連，同時獲得間充質細胞表型。該過程的特點表現(xiàn)在特異性上皮蛋白表達降低，包括E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和緊密連接蛋白-1(ZO-1)，隨后是間充質特異性蛋白的表達增加，包括α-平滑肌肌動蛋白(α- SMA)、波形蛋白(vimentin)和層粘連蛋白(laminin)。此外，有研究表明，抑制腎臟中EMT可顯著改善腎纖維化并且遏制DN的發(fā)展[5]。

成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor, FGF21)是一種重要的代謝調節(jié)因子，研究報道FGF21在多種糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮了有益的生物學效應[6,7]。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21干預能有效預防1型和2型糖尿病誘導的早期腎細胞凋亡及后期DN[4]。雖然在前期研究中發(fā)現(xiàn)FGF21干預能抑制糖尿病腎臟中CTGF的表達，但CTGF只是分子層面表征腎纖維化的多種標志物之一。僅以此為基礎推斷FGF21在DN小鼠的腎臟中發(fā)揮抗纖維化作用，結論不充分。因此，本研究通過多次小劑量STZ腹腔注射誘導1型糖尿病并制備糖尿病腎臟纖維化模型用以考察FGF21干預能否通過抑制EMT過程，降低腎臟中ECM過度積聚，最終預防1型糖尿病DN腎纖維化的發(fā)生，以此為防治1型DN找到新的分子機制。

材料與方法

1.材料與試劑：C57BL/6J小鼠購自南京大學模式動物研究所,STZ購自美國Sigma公司，F(xiàn)GF21購自溫州醫(yī)科大學藥學院，血清和尿液腎功能試劑盒分別購自美國BioAssay Systems公司和美國BioAssay Systems公司，抗體結締組織生長因子(CTGF)、纖連蛋白1(FN1)、Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)、膠原蛋白Ⅰ(Col Ⅰ)、膠原蛋白Ⅱ(Col Ⅱ)、膠原蛋白Ⅳ(Col Ⅳ)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、磷酸化鈣黏蛋白(p-cad)、足細胞裂孔膜蛋白(nephrin)、緊密連接蛋白-1(ZO-1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)及層粘連蛋白(laminin)均購自美國Cell Signaling公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，Nanodrop 2000光譜儀由美國Thermo Fisher Scientific提供，Stratagene MX3000p熱循環(huán)儀由美國Agilent StrataGene公司提供，反轉錄試劑盒購自美國PE Applied Biosystems公司。

2.實驗動物分組及處理：32只8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為:正常對照組(Con組)、FGF21組(FGF21組)、糖尿病組(DM組)和治療組(DM/FGF21組)。連續(xù)5日利用鏈脲佐菌素(STZ)(溶于10mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液，pH值4.5)多次小劑量(50mg/kg)腹腔注射DM組和DM/FGF21組小鼠，最后一次注射后7天尾靜脈取血，檢測血糖水平，超過250mg/dl即認定成模，對照組注射相同體積的溶媒(檸檬酸鹽緩沖液，pH值4.5)。成模后按分組給予FGF21腹腔注射處理4個月[100μg/(kg·d)]。記錄小鼠血糖和體重。 處死小鼠后，收集血清后檢測各組小鼠脛骨長、腎重、腎功能水平、腎臟纖維化情況、與ECM相關纖維化指標以及EMT生物標志物的表達水平。

3.腎功能檢測：成模4個月后使用代謝籠收集小鼠24h尿液，收集后的尿液于1400r/min離心15min(4℃)，分離保存上清，并記錄相應體積。應用試劑盒對尿液及處死小鼠后收集的血清檢測多項腎功能指標包括尿蛋白、尿微量白蛋白、尿肌酐、尿蛋白、尿微白蛋白、血清肌酸酐，血尿素氮及尿白蛋白/尿肌酐。

4.組織學染色：將小鼠腎組織在室溫下于10%甲醛溶液中固定48h。脫水后進行石蠟包埋，切成4mm厚的塊，根據(jù)說明書，用蘇木精-伊紅(HE)染色進行一般形態(tài)學檢查，糖原(PAS)染色評估腎小球硬化，天狼星紅(Sirius Red)染色和Masson三色染色評估代表纖維化的膠原蛋白的累積[7～9]。

5.RNA分離和定量QPCR的檢測：使用TRIzol試劑從腎組織分離總RNA，Nanodrop 2000光譜儀定量每個樣品中總mRNA的濃度后，按照反轉錄試劑盒說明書將mRNA樣品反轉錄成cDNA，再用QPCR定量各纖維化指標的表達水平，通過比較CT方法計算mRNA的量。

6.Western blot法檢測：將腎組織在裂解緩沖液中勻漿，隨后4℃，12000×g離心15min，留取上層清亮部分。在10%SDS-PAGE電泳上分離每個等量蛋白質的樣品并電流轉膜至硝酸纖維素膜上。在室溫下，膜于脫脂牛奶中封閉1h后，在4℃下一抗孵育過夜：CTGF、FN1、PAI-1、ColⅠ、Col Ⅱ、Col Ⅳ、E-cadherin、p-cad、nephrin、ZO-1、α-SMA、vimentin、laminin 在含有0.05%Tween 20的Tris緩沖鹽水中洗滌3次后，將膜在室溫下二抗孵育1h。最后，發(fā)光液曝光并使用Quantity One軟件進行灰度分析。

結 果

1.FGF21干預改善腎臟肥大及腎臟功能紊亂：糖尿病小鼠腎臟重量與脛骨長度的比率顯著增加，糖尿病組小鼠尿量、尿蛋白含量、血肌酐水平、尿微量白蛋白水平、血尿氮水平和尿白蛋白/尿肌酐比率均增加。但給予FGF21干預后可顯著改善腎肥大和腎臟功能紊亂(表1)。

表1 FGF21干預對DN小鼠腎功能的影響

與Con組比較，*P<0.05;與DM組比較，#P<0.05

2.FGF21干預可改善糖尿病腎臟的腎小球硬化和纖維化：蘇木精-伊紅染色(HE染色)和糖原染色(PAS染色)結果顯示，糖尿病組小鼠腎臟病理改變明顯，表現(xiàn)為腎小管萎縮、腎小管間質病變、腎小球擴張、腎小球硬化、系膜細胞及基質增生、系毛細血管擴張，而FGF21干預4個月后顯著保護糖尿病小鼠腎臟的結構。此外，天狼星紅染色和Masson染色顯示，糖尿病組小鼠腎小球和腎小管中明顯的膠原蛋白積聚，而4個月的FGF21干預抑制了糖尿病誘導的腎纖維化,詳見圖1。

圖1 FGF21干預對DN小鼠腎臟病理改變和纖維化的影響(×200)A.蘇木精-伊紅染色;B.糖原染色;C.天狼星紅染色；D.Masson染色。A～D顯示腎小球硬化和膠原沉積，黑色箭頭表示上述病理改變；E.系膜基質參數(shù)；F.天狼星紅染色分析參數(shù)；G.Masson染色分析參數(shù)。E～G分別為對糖原染色、天狼星紅染色和Masson染色切片進行腎小球硬化和膠原蛋白累積的半定量分析。與Con組比較，*P<0.05;與DM組比較，#P<0.05

3.FGF21干預抑制腎臟中ECM累積相關的糖尿病腎纖維化：糖尿病組小鼠的CTGF(ECM合成的強誘導物)的表達以及經典基質蛋白的表達，包括FN1，Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原和Ⅳ型膠原均顯著增加，且被認為是炎癥和纖維化標志物的PAI-1的表達也明顯上調。此外，QPCR測定顯示，糖尿病組中上述ECM標志物的mRNA水平也增加。 而在FGF21干預4個月后顯著抑制了糖尿病腎臟中ECM mRNA和蛋白質表達(P<0.05，圖2)。

圖2 FGF21對糖尿病腎臟中ECM和腎纖維化標志物的mRNA表達的影響A～D為腎臟中ECM沉積相關的經典標志性蛋白表達水平(A.FN1;B.Col Ⅰ;C.Col Ⅱ;D.Col Ⅳ)。E、F為腎纖維化和炎性反應的多種標志物的蛋白表達水平(E.CTGF；F.PAI)。G～L為通過qPCR獲得的上述標志物相應mRNA水平(G.FN1；H.Col Ⅰ；I.Col Ⅱ；J.Col Ⅳ；K.CTGF；L.PAI)。與Con組比較，*P<0.05;與DM組比較，#P<0.05(n=8)

4.FGF21抑制糖尿病腎臟中的EMT。如圖3所示，糖尿病組小鼠的EMT顯著增強(P<0.05)，體現(xiàn)在E-cadherin和ZO-1的表達降低，而間充質細胞標志物的表達增加，包括α-SMA、vimentin和 lamini。通過FGF21干預4個月后，抑制了上述EMT過程(P<0.05)。FGF21誘導的糖尿病腎臟對EMT的預防作用與抑制負轉錄調節(jié)因子Snail、Twist和Slug有關。在治療組中，來源于足細胞的P-cadherin的在腎臟中表達上調(P<0.05)，而糖尿病組中Nephrin表達在腎臟中明顯下調(P<0.05)。

圖3 FGF21對DN小鼠腎臟中EMT過程的表達的影響A～C為E-cadherin的負轉錄調節(jié)因子的蛋白表達水平(A.Snail；B.Twist；C.Slug)。D～I為EMT過程的間充質細胞標志物蛋白表達水平(E.E-cadherin；F.ZO-1；G.α-SMA；H.vimentin；I.Laminin)。J、K為來源于腎小球的黏附蛋白表達水平(J.P-cadherin；K.Nephrin)。與Con組比較，*P<0.05;與DM組比較，#P<0.05(n=8)

討 論

FGF21是FGF家族的成員，其在多個器官中以內分泌方式發(fā)揮有益生物學作用[10]。 越來越多的臨床研究表明，患有各種腎病包括慢性腎病(CKD)、腎移植、ESRD、早期糖尿病腎病以及急性腎功能不全在內的患者血液循環(huán)中的FGF21水平顯著增加，表明FGF21高于基礎水平是腎臟保護的一種應激反應[11～16]。該結論研究顯示在患有CKD的小鼠中給予FGF21可維持腎功能。前期研究證實FGF21給予可預防DN，但FGF21缺失會加速DN的進展[9,17]。筆者還發(fā)現(xiàn)FGF21干預抑制糖尿病腎臟中的CTGF表達[18]。 然而，CTGF只是纖維化標志物之一，以此為基礎推斷不足以說明FGF21在DN小鼠腎臟中的抗纖維化作用，因此，需要進行進一步機制探索。

本研究采用多次小劑量(50mg/kg)在小鼠腹腔注射STZ的方法建立1型糖尿病模型。確定成模4個月后，小鼠出現(xiàn)腎功能受損和形態(tài)學異常，其特征為腎小管萎縮、腎小管間質病變、腎小球擴張、腎小球硬化、系膜細胞和系膜基質增生、及毛細管擴張、塌陷。同時，在天狼星紅染色和Masson染色發(fā)現(xiàn)，纖維化也明顯出現(xiàn)在腎小管和腎小球區(qū)域。通過糖原染色發(fā)現(xiàn)，在DM中腎小球硬化十分明顯。上述結果表明在糖尿病腎臟中，腎小管和腎小球均發(fā)生纖維化。此外，糖尿病腎臟中多種纖維化指標的上調和ECM標志物表達水平的增加也進一步證實了腎臟纖維化的演變。然而，通過4個月的FGF21干預顯著抑制了上述所有現(xiàn)象，表明FGF21在DN小鼠的腎中發(fā)揮了抗纖維化作用。

研究表明，EMT在腎臟硬化和ECM積聚中起著重要作用，這是糖尿病腎病的標志[5]。EMT可根據(jù)其發(fā)生的不同生物環(huán)境和相關結果分為3種不同類型， 1型EMT發(fā)生在胚胎開始和器官發(fā)育期間，這是器官重塑和器官進化所必要的過程，并且它的發(fā)生不誘導炎癥、纖維化和惡性轉移。2型EMT發(fā)生能在器官纖維化和組織再生過程，并誘導活化間充質細胞的產生、刺激ECM積聚，最終導致組織損傷。3型EMT一般在腫瘤進展和轉移期間發(fā)生，并且與腫瘤轉移所需的癌細胞基因組和染色體的變化相關。而在糖尿病腎病中EMT屬于2型EMT，其被認為是糖尿病腎纖維化的誘導物。本研究結果顯示，糖尿病腎臟中上皮細胞標志物E-cadherin和ZO-1的表達下降，以及間充質細胞標志物α-SMA、Vimentin、Laminin表達的上調，表明在糖尿病腎臟中EMT過程活躍。同時，腎小球中的EMT在誘導足細胞丟失和腎小球損傷方面也起著重要作用[19,20]，在本研究中觀察到足細胞的特異性標志物p-cad和Nephrin的表達降低。而所有上述EMT標志物的表達通過給予FGF21可得到反向有益調節(jié)，表明FGF21在糖尿病腎病的腎小管和腎小球中對EMT的發(fā)揮抑制作用。

綜上所述，F(xiàn)GF21干預能通過抑制上皮細胞間充質轉化的過程，減少細胞外基質在腎內的積聚，從而減輕糖尿病導致的腎臟纖維化，為防治1型DN提供了新的理論依據(jù)。