PCBP1對神經毒素6-OHDA誘導的小膠質細胞凋亡的影響

賈冰冰 葉 夢 霍麗蓉

帕金森病是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，主要是以紋狀體多巴胺減少和中腦黑質多巴胺神經元凋亡[1]。免疫炎性、線粒體功能障礙、蛋白質聚集和氧化應激是其主要發病機制,目前對癥治療可減緩PD的進展[2]。6-OHDA可引起氧化應激進而導致神經元損傷[3]。有研究顯示，單側腦內注射6-OHDA可導致黑質致密體區中87%多巴胺能神經元的破壞和同側紋狀體中85%多巴胺含量減少[4]。因此，目前6-OHDA被廣泛用于建立PD模型。小膠質細胞主要分布于中腦黑質。激活的小膠質細胞可參與神經變性疾病的發生和發展，貫穿中樞神經系統整個病理變化過程。在PD動物模型中，黑質致密體可通過小膠質細胞產生抗炎反應[5～7]。

PCBP1屬于核不均一核糖核蛋白家族，是一種RNA結合蛋白，含有多聚胞嘧啶[poly(C)]特殊結合位點[8]。核不均一核糖核蛋白家族在人和小鼠組織中廣泛表達，且都含有3個KH同源域。PCBP1可通過KH同源域識別與結合poly(C)DNA,進而發揮重要生物學功能[9]。PCBP1可參與轉錄調控，編碼蛋白可參與主要的細胞功能如細胞增長和細胞周期的調控。為深入研究在神經毒素作用下，過表達的PCBP1是否對BV-2細胞周期有一定影響，本研究通過構建PCBP1重組質粒表達載體，把PCBP1全長cDNA瞬時轉染入BV-2細胞系，并且檢測細胞周期變化，為進一步研究其功能提供可能。

材料與方法

1.材料與試劑：小鼠小膠質細胞系BV-2(首都醫科大學基礎醫學院神經生理室惠贈)；DMEM/F-12培養基，胎牛血清、1%青/鏈霉素、小提質粒試劑盒、感受態細胞Dh5α、限制性內切酶EcoR Ⅰ、LipHigh脂質體高效轉染試劑(上海生物工程有限公司)；反轉錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；PCR Master Mix(北京索萊寶生物科技有限公司)；AnnexinV/PI雙染凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；6-OHDA(美國Sigma公司)；pEGFP/N1-PCBP1重組質粒(本室構建保存)。

2.pEGFP/N1-PCBP1的鑒定：以含PCBP1重組質粒為模板，常規PCR對PCBP1的全長cDNA進行擴增，含Ecol Ⅰ酶切位點，PCR產物經酶切、純化后與真核表達載體pEGFP-N1連接，轉化感受態細菌Dh5α后,篩選出具有卡那霉素抗性陽性單克隆菌株，在液體培養基中搖菌進行擴增，小提質粒后，進行DNA測序和電泳檢測。擴增PCBP1的引物，上游引物為5′-TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG-3′；下游引物為5′-TTCTAGAATTCAACCTACACTGTTCTAGCTGCACC-3′。

3.基因轉染和6-OHDA作用兩組細胞:將對數生長期BV-2細胞按照1×105個/毫升接種于12孔板中，每孔1ml完全培養基進行培養，待細胞的匯片率達到70%～80%時，將原細胞培養基移去，更換為無血清培養基，對細胞進行饑餓處理8h時，將1.6μl pEGFP/N1-PCBP1和pEGFP/N1質粒以及4μl高效轉染試劑分別加入100μl無血清DMEM/F12培養基中，室溫孵育5min后，將轉染試劑加入質粒中，室溫靜置20min，再將混合物逐滴加入細胞中，邊滴加邊搖晃培養皿。細胞培養箱中孵育8h后，更換為DMEM/F12完全培養基。同時設轉染pEGFP/N1-PCBP1質粒設為實驗組、轉染 pEGFP-N1質粒為對照組。轉染 24h時，于熒光顯微鏡下觀察細胞發綠色熒光，明確PCBP1基因轉染成功后，將6-OHDA按照不同劑量(5、15、25μmol/L)作用24h和相同劑量作用不同時間(8、16、24h)的實驗方法滴加到實驗組和對照組細胞中，于細胞培養箱中繼續培養，分別設3個復孔。

4.Annexin V/PE和7AAD雙染法檢測細胞周期：收集實驗組和對照組經6-OHDA介導后的BV-2細胞，置于離心管中，5min,1000r/min常溫下進行離心。再用4℃預冷的PBS對細胞進行洗滌，重復洗滌后，用1×結合緩沖液重懸細胞，取約100μl細胞懸液加入流式管中，加入5μl Annexin V/PE混勻，室溫避光孵育5min；再加入7AAD 10μl,立即進行流式檢測。

結 果

1.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1鑒定:重組質粒pEGFP/N1-PCBP1，轉化感受態細胞，于含卡那霉素的LB液體培養基置于搖床上進行搖菌，提取質粒，進行測序鑒定，結果顯示cDNA序列及插入位點均正確，詳見圖1。

圖1 DNA測序分析重組質粒pEGFP/N1-PCBP1箭頭所指為PCBP1基因插入質粒的相應位點

2.質粒轉染BV-2細胞:用重組pEGFP/N1-PCBP1和對照質粒 pEGFP/N1分別對BV-2細胞進行轉染，轉染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP/N1和pEGFP/N1-PCBP1可發可發出綠色熒光，詳見圖2。

圖2 pEGFP/N1及pEGFP/N1-PCBP1在BV-2細胞中的表達(×40)A.對空載質粒pEGFP/N1在 BV-2細胞中的表達；B.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1在 BV-2細胞中的表達

3.過表達PCBP1基因對BV-2細胞周期的影響:不同濃度(5～25μmol/L)6-OHDA對BV-2作用24h后，實驗組和對照組細胞早期凋亡率逐漸增加，實驗組為4.63%±1.48%、7.61%±0.39%、12.12%±0.62%；對照組為8.95%±0.47%、14.23%±0.23%、19.40%±2.42%，且實驗組和對照組比較，早期凋亡率明顯減低，差異有統計學意義(P<0.05)，晚期凋亡率無明顯變化，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1、圖3。 6-OHDA 25μmol/L作用8、16、24h后，實驗組和對照組細胞隨著時間延長，早期凋亡率逐漸增加，實驗組為6.99%±0.61%、9.40%±0.50%、12.12%±0.62%；對照組為13.03%±0.37%、15.01%±0.79%、19.40%±2.42%，但同一時間，早期凋亡率實驗組低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組細胞晚期凋亡率隨作用時間無明顯變化，兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表2、圖4。

表1 不同濃度6-OHDA分別對實驗組和對照組作用24h后細胞凋亡率變化

對照組為轉染空載質粒pEGFP/N1的BV-2細胞；實驗組為轉染重組質粒pEGFP/N1-PCBP1的BV-2細胞。與對照組同濃度比較，*P<0.05

圖3 不同濃度6-OHDA分別對實驗組和對照組作用24h后細胞凋亡率的流式檢測結果A.對照組細胞5μmol/L 6-OHDA;B.對照組細胞15μmol/L 6-OHDA;C.對照組細胞25μmol/L 6-OHDA；D.實驗組細胞5μmol/L 6-OHDA;E.實驗組細胞15μmol/L 6-OHDA;F.實驗組細胞25μmol/L 6-OHDA；其中右上象限為晚期凋亡細胞,右下象限為早期凋亡細胞

表2 25μmol/L 6-OHDA對實驗組和對照組作用不同時間后細胞凋亡率變化

與對照組同時間比較，*P<0.05

圖4 25μmol/L 6-OHDA分別對實驗組和對照組作用不同時間后細胞凋亡率的流式檢測結果A.對照組細胞6-OHDA作用8h;B.對照組細胞6-OHDA作用16h;C.對照組細胞6-OHDA作用24h；D.實驗組細胞6-OHDA作用8h;E.實驗組細胞6-OHDA作用16h;F.實驗組細胞6-OHDA作用24h；其中右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞

討 論

目前，細胞凋亡被認為是神經系統疾病發生的機制之一，然而除了細胞壞死,神經細胞可出現其他細胞死亡過程[10]。在帕金森病中，紋狀體區的多巴胺神經元出現凋亡和壞死[11]。有研究顯示交感神經元暴露于多巴胺導致細胞收縮和核碎裂。這些結果表明帕金森病中的黑質細胞變性可能是由于不適當的多巴胺誘導的死亡，死亡的多巴胺神經元顯示出一些細胞凋亡形態特征[12]。

PCBP1通常被稱為RNA結合蛋白，存在3個hnRNP K同源性(KH)結構域，約70個氨基酸與RNA結合[13]。PCBP1通過與多聚胞嘧啶結合可發揮多種功能，其功能繁多復雜，包括mRNA穩定、轉錄后修飾、翻譯激活和剪切[14，15]。PCBP1是一種多功能蛋白分子，研究表明，PCBP1與鐵離子轉運、病毒復制、腫瘤等疾病有密切聯系，而PCBP1與神經系統疾病發生與發展的研究也日益增加[16～18]。神經絲(NF)是最豐富的細胞骨架共同體，它們組成了一個有髓鞘的無脊椎動物軸突神經元中間絲蛋白家族。通過親和純化的質譜法，發現來自大鼠腦的蛋白質鑒定出3種K-同源性(KH)結構域RNP-hnRNP K，hnRNP E1，hnRNP E2-能夠結合NF-M RNA。hnRNPs K、E1和E2是涉及NF基因表達的重要信息轉錄調控子。研究發現NF mRNAs確實與這些RNP內源性結合，且其結合程度在出生后隨著神經發育過程而發生改變，這些關聯程度的改變依賴于RNP或NF-L、M、H mRNA信息的豐富程度，同樣表明RNA-蛋白質之間的相互作用可被直接調控[19]。本課題組前期研究顯示，PCBP1可促進神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y生長，同樣證明PCBP1對神經細胞的生長狀態具有一定的調節作用[20]。據報道，在病毒感染、細胞凋亡和熱休克過程中，細胞內的核糖體進入位點(internal ribosome-entry site，IRES)可持續表達。Ken Nishimura等研究顯示，在IRES的翻譯中，PCBP1可與ORF57相互結合，進而增強凋亡抑制子的活性。該研究證實PCBP1主要通過IRES來調節細胞和病毒基因的表達，進而發揮抗凋亡作用。

對于PCBP1基因與神經細胞周期變化是否存在一定的關聯鮮有深入探討。本研究通過將將重組質粒pEGFP/N1-PCBP1轉染入BV-2細胞，使其在BV-2細胞中過表達。將不同劑量6-OHDA對轉染PCBP1的BV-2細胞作用24h后，結果顯示，實驗組和對照組細胞比較，早期細胞凋亡率明顯減低(表1、圖3)。再將25μmol/L的6-OHDA分別對轉染PCBP1的實驗組和對照組細胞作用不同時間后，進行流式細胞儀檢測。結果顯示實驗組較對照組BV-2細胞的早期凋亡率同樣明顯減低(表2、圖4)。而在上述實驗中，實驗組和對照組細胞的晚期凋亡率比較差異無統計學意義。實驗結果提示，在神經毒素作用條件下，PCBP1對神經細胞周期的干預作用主要體現在早期凋亡階段。當神經細胞進入晚期凋亡時期，PCBP1并不能起到有效阻斷作用。將進一步探討該蛋白阻斷神經細胞發生早期凋亡事件的生物學機制。希望能夠為存在神經細胞凋亡、壞死相關的神經系統退行性疾病如PD，提供更加有效的治療手段。