異氟烷預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后P13—K/AKT信號通路的影響

張競超 張偉晶 周曉娜

【摘 要】目的：探討異氟烷預處理對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的保護作用機制與磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3-K/AKT）信號通路的相關性。方法：將36只SD雄性大鼠按隨機數字表法分為3組：假手術組、模型組及異氟烷組。采用線栓法制備右側大腦中動脈閉塞模型，缺血2h再灌注24h后進行神經功能缺損評分。氯化三苯基四氮唑（TTC）染色檢測腦梗死面積，免疫組化法檢測PI3-K、p-AKT表達。結果：與模型組比較，異氟烷組神經功能缺損程度明顯減輕，腦梗死體積明顯減少，PI3-K、p-AKT陽性細胞表達明顯增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：異氟烷通過激活PI3-K/AKT信號通路，從而抑制神經細胞凋亡可能是其對腦缺血-再灌注損傷的保護作用機制之一。

【關鍵詞】異氟烷；腦缺血再灌注；PI3-K、AKT

【中圖分類號】R79 【文獻標識碼】A 【文章編號】1005-0019（2019）15-0-01

越來越多的研究證實可吸入麻醉劑的預處理能降低缺血再灌注損傷，在一定程度上修復神經功能，但目前異氟烷預處理的腦保護機制尚不明確[1]。異氟烷（ isoflurance，ISO） 是臨床常用的揮發性麻醉劑，可誘導新生鼠和成年鼠腦的預處理效果[4]。ISO 的預處理在圍手術期可降低腦卒中的發生率，在確保麻醉效果的同時最低程度影響患者腦功能。該研究通過大鼠動物模型神經功能評分、腦梗死面積測定以及PI3-K/AKT的表達率，初步揭示ISO 腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康的成年雄性 SD 大鼠共 36只，重約 250～280 g。依照隨機分組原則將其分成分為假手術組、模型組及異氟烷組，每一組分別包括 12只大鼠。大鼠在進行神經缺損評分后，每組動物中再次按隨機原則選出 6只進行腦切片的TTC染色，余下6只行免疫組織化學檢測。

1.2 揮發性麻醉藥預處理

首先將麻醉機回路和大鼠麻醉箱進/出氣口連接，然后以5L/min氧流量流經異氟烷蒸發罐，蒸發罐開啟濃度為3%，含麻醉藥氣體流經麻醉箱，出氣口連接Solar8000M型麻醉氣體監測儀，待箱內異氟烷濃度達1.0MAC，且穩定10min后將大鼠置入，持續吸入麻醉20min后待大鼠肺內麻醉藥濃度和箱內平衡后，迅速從箱內取出大鼠并將其口鼻部置于相同濃度的大鼠面罩內維持麻醉。

1.3 TTC 染色步驟：

深度麻醉大鼠，經心臟灌注 PB（100mL），斷頭取腦，將腦 組織在 4℃的生理鹽水中冰凍 5min 后，由前極向后沿冠狀面切 2mm 切片，將切片置于2%TTC 的 0.2PBS 中，PH：7.4，37℃避光孵育 30min，每間隔 5nin 輕柔晃動平皿，然后將 TTC 液倒出，在 PBS 中洗三次，每次 1min，最后在 4%的多聚甲醛中固定，相機拍照。

1.4 神經功能評分

使用 Zea-longa 5 分制法，對大鼠神經功能缺損癥狀行量化評分。評分標準： 0 分，未觀察到神經功能缺損的表現； 1 分，手術對側前腿不能完全伸直； 2分，爬行路徑中向手術對側轉圈； 3 分，爬行過程中向手術對側歪倒； 4 分，未觀察到有自發行走，伴或不伴意識障礙； 5分，死亡。評分為 1～3 分且無蛛網膜下腔出血者被視作模型制作成功，納入實驗。

1.5 免疫組織化學染色

腦片經脫蠟、脫水，PBS 液漂洗，進行抗原修復，雙氧水封閉，山羊血清封閉，后加入一抗，4 ℃ 孵育過夜； 次日，室溫復溫 30 min，移去一抗，PBS 液漂洗，滴加二抗（ 山羊抗兔 Ig G） ，置于 37 ℃ 溫浴箱中 20 min后，PBS 液漂洗，經過在 37 ℃ 溫箱中的避光孵育 20 min，PBS液漂洗，DAB顯色，脫水透明封片。陰性對照用濃 度為0.01 mol / L PBS 液代替一抗。鏡下觀察，PI3-K、p-AKT陽性細胞的胞核部分和胞漿部分呈現出棕黃色，記錄 PI3-K、p-AKT陽性細胞占整個視野的比例。

1.6 統計學處理

采用SPSS16.0軟件進行統計處理，實驗結果數據均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，顯著性水準取α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠神經功能缺損評分

模型組和異氟烷預處理組的大鼠在腦缺血再灌注后，神經系統癥狀主要表現為： 左前肢不能完全伸展； 爬行時由于左側肌力下降。模型組與異氟烷預處理組分別與假手術組相比，評分均較高（ P< 0.01） ； 異氟烷預處理組與模型組相比，評分低于模型組（ P<0.05） （見表1）。

3 討論

現代醫學研究認為，急性腦缺血的病理機制主要與興奮性氨基酸、細胞內鈣離子

超載、氧自由基、炎癥反應等因素有關[2]。PI3-K/AKT該信號通路參與了腦缺血的病理過程，而且在缺血早期即給予外源因子提高AKT的表達可以減少缺血腦組織的損傷[3]。PI3-K/AKT 信號轉導通路是膜受體信號向細胞內轉導的重要途徑，在心臟、腎臟、 肝臟等多種器官缺血再灌注損傷中發揮抑制細胞凋亡作用。本實驗結果示，模型組大鼠腦缺血再灌注后形成腦梗死灶，腦組織中PI3-K、AKT表達率較假手術組顯著增高，這說明PI3-K、AKT參與了缺血再灌注損傷過程。

綜上所述，經異氟烷預處理后，大鼠神經功能評分顯著降低，損傷程度更小。腦組織PI3-K、AKT表達率較假手術組顯著增高。可見，異氟烷預處理通過上調PI3-K、AKT信號通路發揮對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。

參考文獻

饒明俐，林世和.腦血管疾病.人民衛生出版社，2002.172.

陳捷.缺血性腦卒中的流行病學.實用心腦肺血管病雜志.2000，8（3）179-181.

程倚萌，托毗醋對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經元凋亡的影響：[學位論文]鄭州：鄭州大學，2007；[l]吳江神經病學.北京：人民衛生出版社，2005，153-159.